王跃进 张剑侠

　　2013年对引进美国的2个无核葡萄品种‘木星’和‘海王星’，采用石蜡切片技术和铁矾苏木精染色，进行胚、胚乳发育的细胞学形态观察，了解其胚、胚乳的发育和败育过程，旨在确定其用作胚挽救母本时的最佳取样时期。具体技术方法如下：

　　1　幼果取样

　　分别从‘木星’和‘海王星’花后30d开始取样，每隔1d取一次样，每次取果粒5粒。取样时选取植株上中下部生长势一致的果穗，于果穗中部随机取一粒浆果，放入冰盒中带回实验室。

　　2　制片与观察

　　将采集幼果，立即剥取胚珠，称重，并将其快速置于用卡诺氏固定液（Carnoy's Fluid or carnoysfixative）中固定24h，后期胚珠较硬，先将其置于5%NaOH溶液中软化2周左右，解剖刀能顺利无阻地剖开为宜。将固定好的胚珠进行梯度脱水（70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，每级2h），随后进行透明（1:1乙醇：二甲苯、二甲苯、二甲苯，每级1h），之后浸蜡（57℃，48h）包埋，制成10um厚的石蜡切片，将切片放入染色缸中进行脱蜡，脱蜡过程中先使用二甲苯，然后是二甲苯：酒精=1:1，再分别使用100%、95%、85%、75%的酒精。随后，用4%铁矾进行媒染1h，再用0.5%的苏木精染色4-5h，期间进行观察染色情况，然后用流水冲洗分色，依次转入50%乙醇二甲苯和二甲苯中，用中性树胶进行封片。Olympus显微镜下进行镜检，选择有说明性的切片拍照。细胞学时期确定参考胡适宜的图片。

　　3　观察结果

　　无核品种‘木星’、‘海王星’胚开始发生败育的时期分别是盛花后38d和36d，因此这2个时期分别是它们用作胚挽救母本时的最佳取样时期。