寒区品种选育岗位

郭修武 朱骏驰 郭印山 刘镇东 李坤 李成祥

　　在葡萄遗传育种研究中，获得继承双亲基因的真杂种后代是有目的开展品种改良及其他遗传研究的前提和基础。由于葡萄闭花受精的习性以及人工去雄套袋不及时等原因，常造成后代中真假杂种苗混杂，因此对杂交后代的真实性鉴定十分必要。对于植物杂交后代的鉴定方法，主要有植株形态学、细胞学、同工酶学以及分子标记等方法。形态学鉴定的周期较长，鉴定结果受环境变化影响较大；细胞学鉴定程序繁琐，技术水平要求较高，且分辨率不高，对于染色体短的和结构差异较小的个体难以准确鉴定。同工酶则由于酶种类限制不能反映全部的结构基因的信息，使分析产生一定的偏差，并且存在基因位点少，多态性水平低等缺点。

　　分子标记技术的发展，为我们提供了从DNA水平即基因水平上来检测后代纯度的有利工具。SSR分子标记技术具有共显性、结果可靠、重复性好、多态性高、检测快速简便等特点。本研究采用SSR技术对欧亚种葡萄杂交组合‘玫瑰香×红地球’实生后代进行杂种的真实性检测，为提高葡萄杂交育种效率奠定基础，且鉴定得到的真实性杂种后代为今后开展遗传图谱构建及重要性状的QTL定位提供材料。

　　1　材料与方法

　　（1）试验材料

　　试验材料为欧亚种葡萄品种‘玫瑰香’与‘红地球’及其杂交实生后代的210个单株，取自于沈阳农业大学葡萄资源圃。取幼嫩叶片于-80℃保存备用。

　　（2）基因组DNA 的提取和检测

　　D N A 的提取采用Hanania(2004)的改良CTAB法。经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测浓度及质量后将样品浓度稀释至10 ng•μL-1，并于-20℃保存。

　　（3）SR反应体系、扩增程序及扩增产物的检测

　　SSR引物信息来源于h t t p : / /www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=2976.，所选用的引物由北京鼎国生物技术公司合成。

　　扩增反应体系总体积16 μL，包括模板DNA 10 ng，Primer 浓度为0.3 μmol• L-1，dNTPs浓度为0.1mmol• L-1，Mg2+浓度为2.0 mmol•L-1，Taq DNA 聚合酶为0.8 U。

　　PCR 扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性1 min，退火1 min（退火温度因引物而异），72℃延伸1 min，24 个循环；72℃最后延伸10 min，4℃保存。

　　PCR扩增结束后，将扩增产物在5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分离，并进行银染检测。

　　（4）杂种SSR鉴定

　　利用SSR12对引物进行亲本间的多态性分析，选择扩增带型清晰、稳定、主带明显、双亲中均表现多态性的引物VLG6-R-1和UDV120作为杂种鉴定的引物。每对引物重复试验三次，以确定结果的准确性

　　2　试验结果

　　（1）基因组DNA 的提取质量

　　对双亲及210 份杂交后代共212份材料的DNA 浓度和质量进行了检测，经紫外分光光度计测定，所提取DNA 的OD260/OD280 比值均介于1.7 ～1.9 之间。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，提取的DNA 为一条清晰完整的带，与λDNA 的位置基本相同，条带没有明显的拖尾，无蛋白质和RNA污染。说明本试验提取的DNA 完整，纯度高，符合本试验的要求。

　　（2）引物筛选

　　将SSR引物组合在双亲中进行PCR扩增，引物在亲本中检测出的多态性条带为1~4个。经过多次重复，筛选出其中条带清晰、稳定的引物，最终确定了在双亲中均有多态性的VLG6-R-1和UDV120引物用于杂种后代的鉴定及验证（图2）。

　　（3）杂种后代的SSR鉴定结果

　　根据引物筛选结果，首先选择引物VLG6-R-1对210株杂种后代进行鉴定，其中95株电泳结果见图3。由于SSR标记为共显性标记，后代中能扩增出具有父母本特异条带的认定为真实性杂种。从图3中的箭头标记可以看出，泳道10，22，51只扩增出母本特异性条带，均未扩增出父本特异性条带，可能为母本自交后代；泳道11，15除了扩增出一条母本特异性条带外还扩增出一条污染的特异性条带，可能为污染杂交后代。95个F1杂交后代群体中，出现包含有父母本特异条带的个体共有90个。

　　试验中检测的210个后代群体中出现包含父母本特异条带的个体为183个，真杂种率为87.14%。用另一对具有父母本特异条带的SSR引物UDV120进行验证，结果表明与引物VLG6-R-1的鉴定结果完全一致，证明了鉴定结果的准确性。

　　3　小结

　　通过对检测出的真杂种植株进行田间生物学性状的观察与比较，这些植株在生长特性，叶片、果实及枝条特征等方面都有父本和母本的某些特征，这进一步说明了鉴定结果的准确性，也进一步说明SSR分子标记用于葡萄杂种真假的鉴定是一种较好的方法。