加工品种选育岗位

唐晓萍团队

　　摘 要：为筛选出酚类物质含量高且具有较高抗氧化活性的酿酒葡萄种质资源，分别以4个红色和4个白色酿酒葡萄成熟果实为材料，比色法测定果皮、果肉和种子中的总酚、单宁总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量，以总还原力、DPPH自由基、ABTS+•自由基清除能力评价其抗氧化能力。结果表明，各品种果皮、果肉和种子中各酚类物质含量具有明显差异，但均以果肉中含量最低。红色品种果皮和种子中酚类物质含量均高于白色品种（‘小白玫瑰455’除外），其中以‘黑比诺667’中总酚、单宁和总类黄酮含量最高，而果皮原花色素和黄烷醇含量以‘蛇龙珠’最高，种子原花色素含量以‘法国蓝’最高。白色品种中，‘小芒森’果皮各酚类物质含量均最低，而种子中含量以‘小白玫瑰455’最高。各葡萄品种果皮和种子的抗氧化能力和其总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量之间均为显著正相关，相关系数在0.8383~0.9983，而果肉中的相关性较弱。选用的3种方法对葡萄果实抗氧化活性进行评价时，测定结果在不同方法间存在协同性与差异性。

关键词：酿酒葡萄；果实；多酚；抗氧化能力

　　0　引言

　　多酚类物质作为葡萄中重要的次生代谢产物之一，对葡萄果实的色泽、风味以及葡萄酒的口感、营养价值都具有重要的作用，在医疗、保健等方面也具有重要的作用和利用价值，因此近年来，葡萄与葡萄酒中多酚物质成为研究的热点。

　　葡萄果实中的多酚主要分布在果皮和种子中，果肉中含量较少。酚类物质在葡萄不同品种及葡萄酒中含量变异极大；而且生长环境条件、定量方法、果实成熟度等对酚类物质浓度也具影响。李杨昕等（2007）对‘玫瑰香’葡萄叶片、茎、卷须中的酚类物质含量和抗氧化活性进行了研究，发现其总酚、类黄酮和原花色素含量随果实的发育呈先下降后上升的趋势，各器官的抗氧化活性与酚类物质含量呈正相关。蒋宝等（2014）以黄土高原地区的‘蛇龙珠’和‘霞多丽’葡萄果实为研究对象，分析了其多酚物质和抗氧化活性，结果表明红色品种‘蛇龙珠’的酚类物质含量和抗氧化能力均高于白色品种‘霞多丽’。葡萄酒的抗氧化能力主要取决于酿酒葡萄果实所含有的多酚类物质。因此，研究葡萄果实（酿酒原料）中多酚物质的种类及其含量，对科学评价葡萄原料和葡萄酒质量及酿酒工艺的实施具有重要的理论与实际意义。

　　为筛选出酚类物质含量高且具有较高抗氧化活性的酿酒葡萄种质资源，以8个酿酒葡萄品种成熟果实为材料，测定果皮、果肉和种子中总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量，用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[1,1-diphenyl-2 - p i c r y l h y d r a z y l r a d i c a l 2 ,2-diphenyl-1-(2, 4, 6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]自由基、2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[diammonium 2,2’-azinobi s - ( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n e - 6 -sulphonate)，ABTS+•]自由基和总还原能力(ferric ion reducingantioxidant power，FRAP)法分析其体外抗氧化活性，用相关系数法分析酚类物质含量与抗氧化活性间的相关性，从而为筛选酚类物质含量高且具有较高抗氧化活性的酿酒葡萄种质资源提供依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验材料

　　供试材料为‘ 品丽珠3 2 7 ’ (Ca b e r n e t Fr a n c ) 、‘ 法国蓝’ ( B l u e F r e n c h ) 、‘ 黑比诺6 6 7 ’ ( P i n o t No i r ) 、‘ 蛇龙珠’(Cabe rne t Ge rni s cht )、‘ 威代尔’ ( Vi d a l ) 、‘ 小芒森’ ( P e t i t Ma n s e n g ) 、‘ 霞多丽’(Pinot Chardonnay)、‘小白玫瑰’455(Muscat blanc a Petit grain)等成熟果实。酿酒葡萄大致可分为红色品种和白色品种。本研究测定的8个品种中，‘黑比诺667’、‘ 品丽珠3 2 7 ’ 、‘ 法国蓝’ 和‘蛇龙珠’是酿造红葡萄酒的品种，而‘霞多丽’、‘小芒森’、‘威代尔’和‘小白玫瑰455’是酿造白葡萄酒的品种。

　　各品种（系）葡萄栽培于山西省农业科学院果树研究所酿酒葡萄营养系选种圃，4年生植株，倾斜式单龙蔓“厂字形”立架栽培，株行距0.8 m×2.5 m。

　　2014年8-10月于各品种（系）果实成熟期于试验田间每品种（系）随机取6个标准果穗，分果穗剪取全部果粒，于保鲜袋中，液氮冷冻，-80℃冰箱保存。11月23日-12月15日在实验室内提取测定果皮、果肉和种子的酚类物质含量和抗氧化能力。

　　1.2　试验方法

　　（1）果皮、果肉和种子的酚类物质含量测定 将液氮冷冻的果粒的果皮、果肉和种子人工剥离，取果皮2 g、果肉6 g、种子2 g，果皮和果肉分别用研钵研磨成浆，用70%乙醇洗入100 mL容量瓶，保证完全转移入容量瓶。室温，超声波，25 min，用70%乙醇定容，过滤入棕色试剂瓶，滤液为总酚提取液。

　　总酚、单宁含量测定采用Folin-Ciocalteu法，表示为mg 单宁酸/(g•FW)。总类黄酮含量按照氯化铝比色法测定，表示为mg 儿茶素/(g•FW)。原花色素含量采用正丁醇-盐酸比色法测定，表示为mg原花色素/(g•FW)。黄烷醇含量测定采用香草醛-盐酸法测定，参照Waterhouse（19）的方法进行，表示为mg 儿茶素/(g•FW)。

　　（2）果皮、果肉和种子的抗氧化能力测定 采用普鲁士兰法评价提取物总还原力，以吸光度（OD值）表示总还原力。DP PH自由基清除能力参照Yemis等（2008）和Brand-Williams等（1995）的方法，结果以清除率(%)表示。

　　ABTS+•清除能力参考Nenadis等（2004）的方法并稍作修改。7 mmol/L ABTS+•工作液的配制方法：准确称取0.0576 g ABTS试剂，用蒸馏水定容至15 mL，使用前加0.264 mL 140 mmol/L过硫酸钾水溶液，室温避光放置12~16 h，用无水乙醇调零后，将吸光度调整至0.700±0.005后备用。将50 μL粗提液加入到3.0 mLABTS+•工作液中，室温避光反应8 min后，在734nm波长处测定吸光度。结果以清除率(%)表示。

　　（3） 统计分析 采用Ex c e l2003与SPS 13.0进行各因子的数据分析与LSD差异显著性分析。

　　2　结果与分析

　　2.1　不同酿酒葡萄品种果实不同

　　部位多酚物质含量的比较由图1可以看出，红色品种果皮中总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量均显著高于白色品种，其中红色品种总酚含量在11.49~13.62 mg单宁酸/(g•FW)，而白色品种总酚含量在3.17~5.10 mg单宁酸/(g•FW)。不同的红色或白色品种果皮多酚含量也有差异，红色品种中，以‘黑比诺667’总酚、单宁和总类黄酮含量最高，其次为‘蛇龙珠’，而原花色素和黄烷醇含量则以‘蛇龙珠’最高，显著高于其他3个品种，总酚、单宁、原花色素和黄烷醇含量均最低的是‘品丽珠327’，总类黄酮含量最低的是‘法国蓝’（图1）；白色品种中，以‘小芒森’总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量均最低，显著低于其他3个品种，而其他3个品种总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量差异均不显著（图1）。由图2可以看出，果肉中酚类物质含量显著低于果皮，其中总酚含量仅在0.120~0.335 mg单宁酸/(g•FW)。不同的红色或白色品种果肉多酚含量也有差异。红色品种中，以‘法国蓝’总酚和总类黄酮含量最高，而单宁、原花色素和黄烷醇含量分别以‘蛇龙珠’、‘黑比诺667’和‘品丽珠327’最高；总酚、单宁、原花色素和总类黄酮含量均最低的是‘品丽珠327’，其中前3个指标显著低于其他3个品种，总类黄酮含量则显著低于‘黑比诺667’和‘法国蓝’，黄烷醇含量最低的是‘蛇龙珠’，显著低于‘品丽珠327’和‘法国蓝’（图2）。

　　白色品种中，以‘小白玫瑰455’果肉总酚、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量均最低，其中总酚和原花色素含量显著低于其他3个品种，而以‘小芒森’单宁含量显著低于其他3个品种；以‘威代尔’果肉总酚、单宁、总类黄酮和黄烷醇含量最高，其中总酚显著高于其他3个品种，而其他3个指标与‘霞多丽’差异不显著；原花色素含量则以‘霞多丽’最高，显著高于其他3个品种（图2）。由图3可以看出，红色酿酒品种种子中酚类物质含量显著低于果皮而高于果肉，其中总酚含量在1.18~4.33 mg单宁酸/(g•FW)，以‘黑比诺667’总酚、单宁、总类黄酮和黄烷醇含量最高，其中单宁、总类黄酮和黄烷醇含量‘黑比诺667’＞‘法国蓝’＞‘蛇龙珠’＞‘品丽珠327’(P≤0.05)，总酚含量‘黑比诺667’＞‘蛇龙珠’＞‘品丽珠327’ (P≤0.05)；种子中原花色素含量‘法国蓝’＞‘黑比诺667’＞‘蛇龙珠’＞‘品丽珠327’ (P≤0.05)（图3）。

　　白色品种除‘小白玫瑰455’外，种子多酚含量显著低于果皮，而以‘小白玫瑰455’多酚含量最高，显著高于其他3 个品种和红色品种，以‘威代尔’种子总酚、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量均最低，其中原花色素含量和黄烷醇含量显著低于其他3个品种，‘小芒森’种子单宁含量最低，分别比‘霞多丽’和‘威代尔’低77.0%(P≤0.05)、64.5%(P＞0.05)（图3）。

　　2.2　不同酿酒葡萄品种果实不同部位抗氧化能力的比较

　　3种抗氧化指标的测定结果表明，不同酿酒葡萄品种果实抗氧化能力不同，果实的不同部位其抗氧化能力也有差异。

　　由图4 可以看出， 红色品种果皮抗氧化能力均显著高于白色品种，与酚类物质含量一致。其中，‘黑比诺667’果皮总还原力和DPPH清除率显著高于‘ 蛇龙珠’，后者又显著高于‘品丽珠327’和‘法国蓝’；ABTS+•清除率由高到低为：‘蛇龙珠’＞‘黑比诺667’＞‘法国蓝’＞‘品丽珠327’ (P≤0.05)。白色品种中，以‘小芒森’抗氧化能力最低，显著低于其他3个品种；总还原力除‘小芒森’外其他3个品种无显著差异，ABTS+•清除率以‘威代尔’最高，显著高于‘霞多丽’和‘小白玫瑰455’，而DPPH清除率以‘霞多丽’最高，分别比‘威代尔’和‘小白玫瑰455’高20.2%(P≤0.05)、10.3%(P＞0.05)（图4）。

　　由图5 可以看出， 红色品种果肉总还原力由高到低为：‘法国蓝’＞‘蛇龙珠’＞‘黑比诺667’＞‘品丽珠327’ (P≤0.05)；‘ 法国蓝’ 和‘ 黑比诺6 6 7 ’ 果肉ABTS+•清除率显著高于‘蛇龙珠’和‘品丽珠327’；DPPH清除率以‘黑比诺667’最高，显著高于其他3个品种，其次为‘法国蓝’ ， 分别比‘ 品丽珠3 2 7 ’ 、‘蛇龙珠’高29.2%(P＞0.05)、69.1%(P≤0.05)。白色品种果肉总还原力由高到低为：‘威代尔’＞‘霞多丽’＞‘小芒森’＞‘小白玫瑰455’ (P≤0.05)；ABTS+•清除率以‘霞多丽’最高，其次为‘威代尔’，仅比‘霞多丽’低1.9%(P＞0.05)，比‘小芒森’和‘小白玫瑰455’分别高16.0%、50.8%(P≤0.05)；DPPH清除率以‘小芒森’最高，其次为‘小白玫瑰455’，显著高于‘霞多丽’和‘威代尔’（图5）。

　　由图6可以看出，红色品种种子总还原力由高到低为：‘法国蓝’ ＞ ‘ 黑比诺6 6 7 ’ ＞ ‘ 蛇龙珠’＞‘品丽珠327’ (P≤0.05)；‘ 法国蓝’ 和‘ 黑比诺6 6 7 ’ 果肉ABTS+•清除率＞‘蛇龙珠’＞‘品丽珠327’(P≤0.05)；‘黑诺667’果肉DPPH清除率最高，显著高于‘蛇龙珠’和‘品丽珠327’。白色品种种子总还原力、ABTS+•清除率和DPPH清除率均以‘小白玫瑰455’最高，显著高于其他3个品种；其他3个品种中，‘威代尔’总还原力显著低于其他2个品种，ABTS+•清除率由高到低为：‘霞多丽’＞‘小芒森’＞‘威代尔’(P≤0.05)，DPPH清除率以‘威代尔’最低，但与其他2个品种差异不显著（图6）。

　　2.3　不同酿酒葡萄品种果实不同部位酚类物质含量与抗氧化能力的相关性分析

　　利用统计学相关软件，针对葡萄果实中酚类物质的5个重要含量指标（总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇）与3个采用不同方法鉴定其抗氧化能力的指标（总还原力、ABTS+•清除率和 DPPH清除率） 进行相关性分析（ 表1~3）。

　　表1中，果皮酚类物质含量的5个指标与3个抗氧化能力指标均呈极显著的正相关关系(P≤0.01)，其中总酚、单宁、总类黄酮与总还原力和DPPH清除率的相关系数均达到0.96以上；除总类黄酮外，其余4个指标与总还原力的相关系数＞与DPPH清除率的相关系数＞与ABTS+•清除率的相关系数。表2中，果肉酚类物质含量的5个指标与3个抗氧化能力指标相关性较弱，其中酚类物质含量的5个指标与ABTS+•清除率呈极显著的正相关关系(P≤0.01)，且相关系数大小表现为：总类黄酮＞原花色素＞黄烷醇＞总酚、单宁；仅单宁与总还原力和DPPH清除率呈极显著的正相关关系(P≤0.01)，黄烷醇与总还原力呈显著的正相关关系(P≤0.05)。

　　表3中，种子酚类物质含量的5个指标与3个抗氧化能力指标均呈极显著的正相关关系(P≤0.01)，其中与总还原力和DPPH清除率的相关系数均达到0.95以上；与ABTS+•清除率的相关系数均达到0.83以上，且相关系数大小表现为：总类黄酮＞单宁＞总酚＞原花色素＞黄烷醇。

　　3　讨论

　　酚类物质含量丰富的葡萄原料是酿造高品质葡萄酒的重要条件。酚类物质主要就分布在叶片、种子和果皮中，果肉中的含量很少，这与本研究结果一致，8个葡萄品种果皮总酚含量在3.173~13.616 mg单宁酸/(g•FW)，种子酚类物质含量在0.266~10.216 mg单宁酸/(g•FW)，果肉酚类物质含量仅0.123~0.335mg单宁酸/(g•FW)，不同品种间存在差异，这可能与品种特性有关。而且研究结果表明，红色品种果皮中总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和总黄烷醇的含量均高于白色品种，与前人研究结果一致（李华等，2005），所以由红色品种的葡萄原料酿造的葡萄酒具有更强的健康属性。

　　葡萄多酚化合物的抗氧化作用表现在如抑制蛋白质及脂质的氧化、减少H2O2的形成、抑制抗氧化酶系统调节表达、阻止低密度脂蛋白固醇氧化等，同时葡萄多酚还具有较强的清除自由基的能力，如羟自由基、过氧化氢自由基、超氧自由基等（王晓宇，2008）。因此抗氧化能力测定的方法也非常多，通常需要将2种以上且抗氧化机理不同的方法结合起来，并对选用方法进行优化以此来提高测定结果的客观性。蒋宝等（2014）的研究表明,采用DPPH和CUPRAC法对‘蛇龙珠’和‘霞多丽’果实抗氧化活性进行评价时，测定结果在不同方法间存在协同性与差异性。本研究采用3种方法对葡萄果实抗氧化能力进行了评价，不同品种间存在差异，而且同一品种同一部位采用3种方法评价结果也存在差异性，但总体是一致的。各品种葡萄果皮和种子的抗氧化能力和其总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量之间均为显著正相关，相关系数在0.8383~0.9983(P<0.01)，这表明葡萄的抗氧化能力主要来自果实酚类物质。果肉抗氧化能力和酚类物质含量的相关性较弱，这可能与果肉中酚类物质含量较低有关。