陈国品 白先进 李洪艳 韩佳宇 盘丰平 谢蜀豫 曹慕明
摘要：研究广西一年两收葡萄二收果果实成熟过程中的有机酸含量动态变化, 为酿造工艺与产品类型的制定及今后葡萄果实品质性状的改良和调控提供理论依据。在葡萄转色期至果实成熟生长过程中各种有机酸的变化进行反相高效液相色谱法测定比较果实中的柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸含量。结果表明：酒石酸、苹果酸为广西一年两收葡萄二收果主要有机酸。不同品种在果实发育成熟过程中，各有机酸呈动态下降趋势，且不同品种之间有机酸含量存在差异。柠檬酸和草酸含量很小，且在葡萄成熟过程中含量变化不大。
关键词：葡萄；有机酸；反相高效液相色谱；一年两收；冬果
有机酸是葡萄和葡萄酒的重要风味物质, 其组成和含量与葡萄和葡萄酒感官品质密切相关。葡萄果实中的有机酸主要有苹果酸、酒石酸和柠檬酸，还有少量的草酸、琥珀酸等（Lamikanra,1995），其中酒石酸为葡萄酒提供了骨架物质(Deblot,2006)。果实中的酒石酸是葡萄酒酸味的主要来源，不仅参与了葡萄酒味感的平衡，还决定了葡萄酒的pH，进而影响了葡萄酒微生物和物化稳定性以及颜色稳定性，还可影响葡萄酒的陈酿潜力(问亚琴,2009; 赵新节,2002;Boulton,1980)。因此，葡萄果实中有机酸对葡萄酒的组成成分、稳定性和感官品质都起着重要作用(Lanikanra,1997; Vaughn,1955)，分析葡萄果实中有机酸的种类及量，对优质葡萄生产有重要的指导意义。张军等（2004）研究认为葡萄果实成熟过程中，柠檬酸含量很小，小于0.4g/L，且在葡萄成熟过程中含量变化不大。葡萄中的酒石酸和L-苹果酸含量在葡萄成熟过程中逐渐降低，其中L-苹果酸降低的趋势比酒石酸要大。成冰等（2013）研究新疆玛纳斯28种酿酒白葡萄和27种红葡萄的有机酸含量。结果表明，酿酒葡萄中的主要有机酸是酒石酸、苹果酸和柠檬酸，草酸、琥珀酸和乳酸含量较少；酿酒白葡萄中有机酸总量显著高于酿酒红葡萄，除苹果酸在酿酒红葡萄中的含量高于白葡萄以外，其他5种有机酸在酿酒红葡萄中的含量均较低。不同酿酒葡萄间有机酸含量变化较大。陈虹颖等（2012）研究河北昌黎几个酿酒葡萄品种（赤霞珠、美乐和品丽珠等）及其品系的果实中4种有机酸（酒石酸、苹果酸、柠檬酸和草酸）的含量。结果表明：同一品种不同品系间果实有机酸含量存在显著差异；不同定植地点的赤霞珠果实有机酸含量也存在一定差异；不同品种的酿酒葡萄其有机酸含量也有所不同。在广西葡萄一年两收栽培模式下，未见有探讨不同酿酒葡萄品种二收果果实各种有机酸变化的研究报道。本研究以巨峰、赤霞珠、桂葡一号二收果为材料，研究葡萄果实在成熟过程中主要有机酸含量的变化，为酿造工艺与产品类型的制定及今后葡萄果实品质性状的改良和调控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2013年11月进行，供试材料为广西农业科学院葡萄园内露地栽培的10年生巨峰、3年生赤霞珠和桂葡一号3个葡萄品种。3个葡萄品种均种植同一果园，日常管理方法相同。在果实着色初期（果实果面约10%着色）开始采样，从已标记的植株果穗上每7d从不同方位分别随机选取200个果粒，直到果实成熟采摘。样品采下后立即放入随身携带的冰盒里，当天即带回实验室于-80℃冰箱保存待测。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂
标准品：草酸(Dr.Ehrenstor ferGmbh公司)、酒石酸(Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司)、苹果酸(chromadex公司)、柠檬酸（supelco公司
）；色谱纯甲醇（Merck公司），优级纯磷酸（沪试），分析纯磷酸氢二铵(沪试）。
1.2.2 仪器与设备
安捷伦1260型高效液相色谱仪，
带可变波长紫外检测器；KQ2200DE型超声波清洗器，FE20plus型酸度计。无菌针头过滤器(0.45μm，聚四氟乙烯(PTFE)膜)、低温离心机、榨汁机。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：Ultimate® AQ-C18（3μm,4.6*200mm）；柱温：30℃；流速：0.3ml/min；进样体积：20μL；检测波长：210nm；流动相：1%甲醇-磷酸氢二铵水溶液（PH=2.6），使用前过0.22μm滤膜，超声脱气15min。
1.2.4 有机酸标准品的配制
准确称取适量有机酸标准品（精确至0.1mg），置于50ml容量瓶，用超纯水溶解并定容至刻度，此溶液作为标准储备液，将标准储备液用
流动相稀释成不同浓度的标准溶液，上机进样，以有机酸浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积（mAU）为纵坐标，建立线性回归方程。
1.2.5 样品提取方法
准确称取已混合均匀搅碎的葡萄浆25.0g，加入超纯水50ml，均质2min，超声提取30min,抽滤，滤液定容至100ml，进样前过0.22μm滤膜。
1.2.6 数据处理
所有实验数据的平均值、图形生成运用Excel进行分析。
2 结果与分析
2.1 最佳条件选择
综合流动相、流动相pH、保留时间、不同柱温柱温、流速等对分离有机酸的影响，选择0.01mol/L的(NH4) 2HPO4溶液（H3PO4调pH=2.6），柱温为30℃，流速为0.3ml/min。葡萄样品中有机酸能得到较好的分离。见图1和图2。
2.3 有机酸线性关系及检出限
以不同浓度的有机酸混合标样结合上述最佳条件进样，建立线性回归方程。如下表1，其结果相关系数为0.9988～0.9992,相关系数均大于0.99，检出限(S/N=3)为1ng～5ng，精密度高。
2.4 不同葡萄品种果实成熟过程中柠檬酸含量变化
在葡萄果实成熟发育过程中，3个品种的柠檬酸含量表现出基本一致的波动下降的趋势，且‘桂葡一号’＞‘赤霞珠’＞‘巨峰’（图3）。柠檬酸在巨峰、赤霞珠葡萄中含量很小，小于0.4mg/g，且在葡萄成熟过程中含量变化不大。而桂葡一号在果实成熟期间柠檬酸含量在前期变化不大，12月3日以后柠檬酸的含量迅速下降。至成熟采摘前，巨峰、赤霞珠、桂葡一号柠檬酸含量降低到最低，分别为0.20、0.29、0.62mg/g。
2.5 不同葡萄品种果实成熟过程中苹果酸含量变化
从图4可以看出，在葡萄果实成熟发育过程中，3个品种的苹果酸含量基本上呈下降的趋势。其中，赤霞珠、巨峰两个品种在果实成熟过程中苹果酸含量较接近，且变化也较一致，赤霞珠、巨峰在12月3日苹果酸含量分别下降了7.83、2.96mg/g，之后变化不大，小于1mg/g。而桂葡一号在12月10日苹果酸含量下降了7.71mg/g，之后又有所上升，至成熟采摘又有一定程度的降低，不过变化幅度不大。总体上，桂葡一号葡萄在果实成熟过程中苹果酸含量远高于其他两个品种。
2.6 不同葡萄品种果实成熟过程中酒石酸含量变化
从图5可以看出，在葡萄果实成熟发育过程中，酒石酸含量在赤霞珠、巨峰葡萄中变化不大，而在桂葡一号呈现逐渐下降的趋势，且‘桂葡一号’＞‘赤霞珠’＞‘巨峰’。至果实成熟采摘赤霞珠、桂葡一号葡萄中酒石酸含量接近。
2.7 不同葡萄品种果实成熟过程中草酸含量变化
通过对不同葡萄品种果实成熟过程中的草酸含量进行测定结果(图7) 表明，
草酸的含量很低，最高为0.32mg/g,最低为0.09 mg/g。巨峰、赤霞珠草酸含量变化较一致，呈动态上升趋势，在而桂葡一号在11月26日之后，变化不大。
3 结论与讨论
不同果实在不同时期积累的有机酸种类有所不同。Lamikanra等(1995)对葡萄的研究发现，苹果酸含量随着果实的生长发育逐渐上升，发育中期苹果酸的含量达到最大值，而柠檬酸含量在果实生长至成熟过程中呈现下降的趋势。Kliewer等(1971)研究认为果实成熟期间苹果酸的质量含量和温度呈负相关，而Ｒuffner等（1976）也发现转色期后苹果酸受温度影响大。柠檬酸有清爽宜人的味道，会带给人一种持续的味觉刺激，因此柠檬酸含量越高，风味越好[陈海菊,2010]。张军等(2004)测得河北沙城镇产雷司令和琼瑶浆的柠檬酸几乎为0。Zheng Yanjun等（2009）报道北京昌平区产赤霞珠和北醇(Beichun，Vitis vinifera×V.amurensis)中柠檬酸含量均为0.2g/L。崔婧（2010）测得河北怀来县产霞多丽和赤霞珠中柠檬酸含量分别为0.5g/L和0.3g/L。Liu Huaifeng等（ 2 0 0 6 ）
发现酿酒葡萄( 北京中国科学院资源圃)酒石酸含量平均4.99g/L(2003年)和5.02g/L(2004年)显著高于苹果酸含量2.20g/L和4.09g/L。Cunha等（2002）报道葡萄牙产的5种酿酒葡萄酒石酸、苹果酸和柠檬酸分别为2 . 5 0 3 、1.446g/L和0.543g/L。Liu Huaifeng等（2006）指出有机酸对气候非常敏感，且苹果酸对气候的敏感度高于酒石酸。
本研究表明，酒石酸、苹果酸为广西酿酒品种二收果主要有机酸，不同品种在果实发育成熟过程中，各有机酸呈动态下降趋势，且不同品种之间有机酸含量存在差异。巨峰、赤霞珠及桂葡一号二收果果实成熟期间酒石酸含量变化为(6.58-5.21,12.35-9.02,18.87-10.00)，苹果酸为（8.88-4.60,12.83-3.80,24.35-17.19），柠檬酸含量变化范围 (分别为0.30-0.20、0.40-0.29、0.98-0.61mg/g)，草酸（0.16-0.25,0.15-0.32,0.08-0.15），柠檬酸和草酸含量很小，且在葡萄成熟过程中含量变化不大。