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加工与贮运研究室 酿酒微生物岗位
葡萄酒酵母在葡萄酒发酵过程中起着非常重要的作用，它将葡萄汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、醛、酯等代谢产物，直接影响葡萄酒的色泽、香气及口感，决定着葡萄酒的质量。而葡萄酒酵母对葡萄酒的影响主要体现在葡萄酒酿造过程中的发酵控制。发酵控制除了涉及到设备、工艺、以及原料等方面外，其核心就是对酿造过程中的各种微生物进行有效的控制和利用，这包括两个方面的含义：一方面是对各种有害微生物如破败性野生酵母和乳酸菌、醋酸菌及霉菌等进行抑制；另一方面则为保证优良酿酒微生物（酿酒酵母和乳酸菌）发酵特性的充分发挥，提供适宜的发酵条件（张春晖，2003）。
异味物质的产生是葡萄酒发酵过程中的一类重要问题。异味物质主要包括醋酸、高级醇（杂醇油）和含硫挥发性化合物。酿酒酵母的发酵还受到酒中某些酚类的影响(Chatonnet.P.,1993)。酵母可以通过酶反应由植物中的酚类前体物质产生乙烯基酚类物质。这些化合物具有刺激性的药味和酚的气味。
葡萄酒发酵过程中会产生痕量的挥发性含硫化合物, 它们挥发性很强, 具有不愉快气味，是葡萄酒中重要的一类污染物质，通常描述为臭鸡蛋味、臭鼬气味、大蒜味或洋葱味。虽然它们的生成水平只有每升数十至数百微克，但其感官刺激作用明显，对葡萄酒风味有破坏作用。
含硫化合物中挥发性最强的是硫化氢(H2S), 主要是由于硫或SO2，被还原成为硫化氢，它具有臭鸡蛋的气味，人对H2S的感觉阈值为0.12～0.37mg/L。硫化氢如再进一步与醇类物质结合可形成硫醇。低级硫醇有毒，有害健康，破坏酒的风味，给人以不愉快的感觉。
1.3.2 硫化氢的形成
硫化氢是在葡萄酒发酵过程中由酵母代谢产生。它是酵母进行硫代谢时的必然产物，虽然不可能完全抑制硫化氢的生成，但有必要通过使其生成量降低到最低阈值来减少其对葡萄酒香气的影响。
（1）含硫氨基酸形成硫化氢过程
在正常发酵过程中，硫化氢的形成主要由含硫氨基酸经酵母代谢分解产生。在发酵前期含硫氨基酸来自葡萄汁；在发酵中、后期有些来源于酵母蛋白质的分解（即酵母老化自溶）。
在发酵前期，由于酵母吸收蛋氨酸后，对半胱氨酸脱巯基酶有抑制作用，可阻遏半胱氨酸的分解，因此，发酵前期由半胱氨酸分解产生硫化氢的作用非常微弱。半胱氨酸分解作用仅在发酵中期，当蛋氨酸被酵母利用消耗浓度下降后才比较明显，此时由半胱氨酸脱巯基酶的催化分解产生的硫化氢逐渐显著。一般发酵前期所产生的少量硫化氢主要由酵母对蛋氨酸的代谢分解产生，与此同时还生成一些其它挥发性硫化物，半胱氨酸在发酵时由于酵母代谢部分可转化为蛋氨酸，因此，由半胱氨酸产生硫化氢的过程部分是经蛋氨酸后分解形成的。
（2）由硫酸盐式硫形成硫化氢过程
硫酸盐进入酵母细胞中后，在ATP-硫酸化酶的催化下，首先被三磷腺苷激活，在进一步的酶促反应步骤后转化为亚硫酸盐，亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原生成硫化氢。经用酿酒酵母研究得知（陈思妘，1990），硫酸盐和亚硫酸盐通过还原作用，按下列途径形成硫化氢：
外源 SO42- 内源SO32- 腺苷磷酸硫酸 磷酸腺苷磷硫酸 SO32- H2S
（3）蛋氨酸及半胱氨酸合成过程中硫化氢的产生
当发酵进行一定时间以后由于蛋氨酸、半胱氨酸等有机硫化物被消耗、分解、利用含量不足时，酵母可以利用硫酸盐作为硫源合成蛋氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸。在此代谢途径中有负二价硫离子为其中间产物。其中部分硫离子可能转化为硫化氢，也可能由于代谢障碍产生硫化氢。
1.3.3 影响葡萄酒中硫化氢含量的因素
1.3.3.1 葡萄的原因
（1）葡萄在生长过程中喷洒的农药
葡萄从幼苗扦插到果实成熟的过程中使用最普遍的农药多是含硫物质（如：石硫合剂和波尔多液等）。在酸性介质中，农药中含有的铁、铜、锡、锌等金属离子，其表面产生的原子氢具有强烈的还原作用，便于H2S 的产生。
（2）葡萄汁中缺乏某些营养物质
由于葡萄不成熟或生产中处理不当，使葡萄汁中缺少酵母生长需要的营养物质，如氮源中游离α－氨基氮的水平不足，维生素中泛酸和吡哆胺的缺乏或半胱氨酸水平高于正常值等都会造成H2S的产生。
Wainwrihgt(1970,1971)研究了维生素中的泛酸和吡哆胺在甲硫氨酸和半胱氨酸合成中必需的辅酶作用(Wainwright,1971、1970)。他依据绝对需求泛酸还是能合成泛酸将几株酵母分成两类。对于某些常见的葡萄酒酵母菌株，其泛酸的需求情况己经确定(Ough,1989)，但是仍然有一些常见菌株的泛酸或吡哆胺需求情况还不清楚。
在许多工业发酵和硫化氢生成原因的实验研究中，仍然可能存在泛酸的作用。添加50-75mg/L水平的泛酸到所有的试验果汁中可以消除泛酸缺乏的影响。
Vos和Gray(1979)最先研究了葡萄汁的氮源水平，尤其是游离氨基氮（FAN）对于形成硫化氢的影响(Vos,1979)。实验材料主要为一个葡萄产区的一个葡萄品种的葡萄汁，结果发现当FAN的水平从100mg/L升高至300~400mg/L时，H2S的水平从100μg/L左右普遍下降到几乎为0。这些研究者认为，硫化物的生成是在可供氨基氮水平较低的情况下，由酵母细胞外蛋白酶水解果汁中的蛋白质，生成的氨基酸，进而释放出硫化物。这些研究者还报道，添加皂土处理，并在发酵之前除去皂土后，降低了硫化物的生成量，但也导致了发酵不完全。添加浓度为160mgN/L和250mgN/L的磷酸氢二铵溶液降低了某些葡萄汁中硫化物的生成量，但这样导致了可供氮源远高于足够正常发酵需要的水平(140~160mgN/L)。
从以上研究可以清楚地看到，游离氨基氮的浓度并不是硫化物生成的唯一因素，而是在许多葡萄汁中还存在变化很广的第二种因素。对这些发现，其他可能的解释是，许多葡萄汁中缺乏泛酸或吡哆胺，或者说游离氨基氮库中某些氨基酸的比例对于硫化物的产生有重要的影响。
1.3.3.2 酵母发酵
酵母发酵产生亚硫酸和SO2 的能力是由其遗传特性决定的，其生成量取决于酵母的遗传基因及葡萄汁中的成分。啤酒酵母可以产生SO2，但发酵能力很低。众所周知，酵母的硫代谢能力是在还原条件下进行的，酵母的发酵能使硫酸盐还原生成亚硫酸，其浓度可达20mg/L，这种还原过程直接关系到葡萄酒的质量。酒中的大部分硫化氢是来自发酵时酵母对含硫氨基酸、硫酸盐和亚硫酸盐的同化作用，以及酵母合成蛋氨酸受抑制时的中间产物（李仲超，2001）。
1.3.3.3 发酵速度
发酵速度对H2S的生成起决定性的作用（H.H.Dittrich,1977）。发酵强度弱，发酵缓慢，H2S 生成量便少；发酵强度大，发酵快，H2S 生成量便多。发酵快慢又受发酵温度、葡萄汁混浊度和数量等多种因素的影响，在20℃～30℃的温度范围内，每升高1℃，发酵速度就可提高10%。由于发酵是一还原过程，提高还原反应强度，终了产物的生成量也就必然增加。近年来，酿酒厂的生产日益向大型化方向发展，发酵容器不断扩大，发酵温度有所提高，发酵强度因之加强，出现硫化氢味的现象增多。目前广泛使用的立式发酵罐工艺，由于液柱太高，不利于H2S 排出，出现硫化氢的现象亦更频繁。
1.3.3.4 人为添加的SO2
由于SO2具有抗氧化和抗菌特性，长期以来在葡萄酒的酿造过程中广泛使用，SO2 中含有的硫酸根可以被还原形成硫化氢。
1.3.3.5 其它因素
在发酵强度减弱时加糖，有利于H2S 的生成；把刚发酵完的葡萄酒倒入含有残留的酒桶内，也会使硫化氢增多。这两种做法都能引起少量H2S 生成，由于此时释出的CO2已很少，这部分硫化氢会一直留在新葡萄酒内（Dittrich.H.H,1977）。对于葡萄汁，有一些研究对在发酵过程中产生硫化物的氨基酸组分进行了统计分析，并未发现硫化物的产生与个别氨基酸或氨基酸族之间有什么对应关系。Wainwright(1971)在多个季节中对有缺陷的葡萄汁中添加氨基酸的影响进行过分析，也未见到添加苏氨酸和甲硫氨酸的量与硫化氢生成水平之间有对应的关系(Rankine,1963)。
1.3.4 降低葡萄酒中硫化氢含量的措施
1.3.4.1 葡萄园管理
在葡萄园的管理中，可通过减少施用含硫的农药，如石硫合剂、波尔多液等，来降低原料中的含硫量。石硫合剂和波尔多液是葡萄园管理中常用的农药，可以预防葡萄生长中的一些常见病害。但同时，这些农药的施用含有大量的金属离子会导致较多的硫化氢的生成。因此在实际生产中，应特别注意用药时间，以防止造成不必要的污染。
在采收时应注意果实的成熟度，避免因缺乏营养物质而造成硫化氢生成量的提高。
1.3.4.2 酵母菌株的选育
由于酵母生成硫化氢是有自身的营养代谢所决定的，所以可以通过筛选低产硫化氢的酵母菌株来达到减少葡萄酒中硫化氢含量的目的。目前比较常用紫外诱导法（尹吉泰,2006a、2006b）进行低产硫化氢酿酒酵母的选育。
目前，低产硫化氢酿酒酵母的筛选有直接法和间接法两种。直接法是直接对酵母生成硫化氢的含量进行检测，如醋酸铅法（尹吉泰,2006b）；间接法则是根据谷胱甘肽对硫化氢的抑制关系，从而筛选出高产谷胱甘肽（尹吉泰,2006a）的菌株来达到低产硫化氢的目的。
1.3.4.3 酿造工艺
葡萄酒的酿造工艺会直接影响葡萄酒的品质。李华（1999）认为，现代工艺学的目的就是：在原料良好的情况下，尽可能地将存在于原料中的所有潜在质量，在葡萄酒中经济、完美地表现出来；在原料质量较差的情况下，则应尽可能掩盖和除去其缺陷，生产出质量相对良好的葡萄酒。
由于葡萄酒的酿造过程中温度、发酵速度、发酵方法、辅料的添加都是人为控制的行为，因此通过对工艺的选择或改进来降低葡萄酒中硫化氢含量的目的是可以实现的。
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