熊岳综合试验站

马丽

　　胚培养是植物组织培养的一个主要方面，就是在特定的条件下， 对植物的胚、胚珠进行离体培养， 使其发育成完整植株的一种技术手段。无核葡萄胚培养就是在有性杂交培育无核葡萄品种时，在无核母本的胚珠败育前对其进行离体培养，使无核葡萄培育率从15.9%提高到100%。

　　1 胚培养的发展

　　胚培养技术早在20 世纪初就作为一种育种手段, 1904年E.Hanning 成功地培养了萝卜和辣椒的成熟胚，并得到胚培苗，这是世界上首例胚培养成功的研究，至今已有100年历史。果树的胚培养技术始于1933年，Tukey首次选用甜樱桃幼胚为试材开展未成熟胚培养研究，是果树胚培养的一个里程碑。

　　假单性结实葡萄的胚易发生早期败育，运用胚培养技术可对其幼胚进行挽救。1982年Ramming 首次利用无核葡萄胚珠培养获得两株无核葡萄实生苗以来，胚培养技术已经成为无核葡萄育种的一个主要手段。迄今为止, 世界上许多国家利用胚抢救技术创造了大量的无核葡萄新资源， 如美国育出PRINCESS(1999)、 Thomcord(2003)、 Sweet Scarlet( 2004)和 Scarlet Royal( 2005)，都是非常优良的无核葡萄品种。我国上海林果所2006-2007审定两个通过胚培养育出的三倍体无核品种，沪培1号，沪培2号。

　　2 无核葡萄胚培养的步骤

　　第一步：采集授粉后30-60d浆果，具体时期因为不同母本而不同。在流水下冲洗半小时，然后在无菌条件下用1%升汞和75%酒精进行浆果消毒。需要注意的是消毒后浆果要用灭菌后的蒸馏水冲洗3-4 遍。

　　第二步：将消毒后的浆果切开取出胚珠，接种到发育培养基中， 在适宜的温、光、湿条件下培养50-60d。需要注意的是取胚时切勿将果肉带入培养基，否则会跟胚珠争夺营养，影响胚珠的正常发育。

　　第三步：将发育的胚珠进行切喙、横切处理，转入到萌发培养基，一般10天左右可以萌发。切喙时一定掌握好位置，切的太多会将胚直接切掉。

　　第四步：将萌发后的胚珠，转入成苗培养基，进行成苗培养。一般在此时一个培养瓶中只放一株， 便于标记株系，减少污染对其他株系的影响。

　　第五步：由于胚培苗本身特弱，在移栽时成活率也比较低，所以需要进行胚培苗复壮，并且扩繁试管苗。

　　第六步：生根处理后20天左右，进行炼苗，温室移栽。

　　3 影响胚培养的因素

　　（1）胚龄和接种时期

　　胚龄是影响胚培养成功的关键因素之一。一般认为只有当植物的胚发育到球形胚之后才容易在人工条件下使其继续发育，并且认为胚发育程度越高，挽救成功的可能性越大 ，所以一些败育极早的品种胚培养成功率很低，不适合做胚抢救的母本。如：无核白、秋无核等。缩小了亲本的选择范围。

　　（2）培养基

　　幼胚的培养多采用MS基础培养基+碳源+琼脂+激素+外源添加物。其中碳源及激素的种类和配比对胚培养起到关键性作用。笔者通过试验发现不同组合、相同取胚时期、不同激素浓度配比培养基，胚珠的发育率、萌发率不同。

　　（3）胚珠处理方式

　　切喙横切处理胚珠萌发效果最好，有报道说剖裸胚效果最好，但是笔者试验发现剖裸陪费工费力， 而且污染几率太高，成功几率很低，这可能跟笔者的操作水平有关。

　　（4）温度和光照

　　果树胚培养过程中，被培养的胚珠是否必须经过一段时期低温、黑暗处理才能打破休眠使其萌发， 是人们一直争论的问题。不同树种、不同研究者研究的结果有所差异。以葡萄为例，低温、黑暗处理可以提高种胚萌发率，但效果不是很明显，没起到决定性作用。

　　（5）胚培苗移栽

　　胚培苗移栽成活率低也是胚抢救育种的一个限制性因素。一般移栽条件要求：胚培苗生长健壮，根系发达，经过自然光锻炼，并保证移栽环境的温湿度，移栽土壤及苗木消毒，调节昼夜温差在8℃左右。这样条件可以大大提高移栽成活率。

　　4 胚培养存在问题与展望

　　一些败育时期极早的品种胚挽救很难成功，缩小了育种的亲本选择范围，如具有优良性状的葡萄品种无核白鸡心、秋无核、无核紫等以现有技术不适宜作为母本进行培养。鉴于胚龄越小越难培养成功， 今后应将延缓胚败育技术与胚培养结合起来。我们已经做了外源激素对葡萄胚珠败育及胚抢救影响的试验，发现6-BA对延迟胚珠败育有一定效果，提高了无核葡萄胚培养成苗率。

　　应该借助分子生物学技术对胚培苗或育种材料进行基因检测，排除自花授粉或体细胞胚发育的后代，并检测目的基因是否存在，从而缩短育种周期，提高育种效率。