酿酒微生物岗位

陆瑶 赵津楠 刘延琳

  微生物群落一直是研究者们非常感兴趣的话题，它们在葡萄和葡萄酒中发挥着巨大作用。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物混合发酵系统，微生物群落多种多样。葡萄酒的整体感官和风味代谢物不仅受葡萄浆果、酿造技术的影响，还受微生物组成的影响。一些研究表明，真菌比细菌对葡萄酒风格的影响更大 (Liu et al. 2020)。

  1 内生丝状真菌研究现状

  寄生在植物组织内，不会对寄主植物造成病害或不良影响，特别是对葡萄具有多种有益功能的微生物被定义为葡萄内生菌 (Fagorzi and Mengoni 2022)。其中，丝状真菌是一个重要的微生物群落。由于与葡萄长期共生，内生丝状真菌进化出了次级代谢途径，这些途径衍生出的功能基因、发酵相关酶（如果胶酶、半纤维素酶、糖苷酶和葡聚糖酶）(Claus and Mojsov 2018) 和活性物质（如白藜芦醇、香豆酸、没食子酸、儿茶素等）(Bokulich et al. 2016; Lu, Shi, et al. 2021)可能会影响葡萄酒的品质。内生丝状真菌随葡萄果实进入发酵过程，其中一些属的相对丰度很高，如链格孢菌（Alternaria）、赤霉菌（Gibberella）、曲霉菌（Epicoccum）和分枝孢菌（Cladosporium）(Ding et al. 2023; Perpetuini et al. 2022)。它们通过与酵母或其他微生物相互作用，影响微生物的生长、发酵能力、香气形成和颜色特征 (Liu et al. 2021; Tofalo et al. 2021)。据报道，内生丝状真菌可通过降低酵母菌的活性来刺激发酵或改善醋酸菌的生长条件 (Wang et al. 2020)。

  此外，它们还与挥发性物质的形成密切相关，而挥发性物质决定了葡萄酒的香气质量

(Liu et al. 2021)。Chen 等人发现，亚隔孢壳（Didymella）和短梗霉属（Aureobasidium）与挥发性化合物 3-辛酮呈显著正相关，3-辛酮可为葡萄酒带来草药和蘑菇的香气 (Chen et al. 2022)。然而，内生丝状真菌的出现可能会通过产生次生代谢物（如灰霉菌Botrytis cinerea的β-葡聚糖）或毒素来延缓其他微生物的活动。有趣的是，酵母菌在整个发酵过程中释放的某些化合物可以吸附毒素，从而降低毒素含量，乳酸发酵过程也可以降低毒素含量，还有其他一些控制霉菌毒素的机制 (Welke 2019)。Scott et al. (2002)发现，虽然葡萄果实中含有青霉及其毒素，但由于使用二氧化硫和发酵使毒素失活，葡萄酒中并不含有青霉毒素。因此，酵母菌和丝状真菌可能有一套独特的相互适应策略以及适应发酵环境的机制。

  2 内生丝状真菌对葡萄酒颜色的影响

  葡萄酒的色泽是评估其整体品质的重要指标之一，不仅直接影响消费者的第一感官印象，也在产品市场竞争力中占据核心地位。葡萄酒中色素主要来源于酚类化合物，这些物质在贮藏过程中可通过自聚反应或与其他组分发生缔合，从而影响色泽的表现形式及其稳定性。通常情况下，色泽稳定被视为葡萄酒质量可靠和产品安全的重要标志。在多酚物质的转化过程中，儿茶素与表儿茶素首先缩合形成单宁类物质，这些单宁随后进一步聚合，生成原花青素。原花青素可与花色苷发生结合反应，生成高分子聚合色素，对葡萄酒色泽的稳定性起到积极作用。同时，酚酸类化合物（如咖啡酸和香豆酸）也可与花色素或酒石酸结合，从而对酒液的色度和显色稳定性产生重要影响。近年来研究表明，某些来源于葡萄体内的内生丝状真菌具有促进酚类物质合成的潜力，尤其在花青素及类黄酮合成方面表现突出。通过调控植物代谢途径，这些真菌能促使葡萄酒呈现出多样化的色调，包括红色、紫色及黄色等。例如，从玫瑰蜜葡萄中分离获得的特定内生真菌菌株，已被证实能够显著提升叶片及浆果中还原糖、总黄酮、总酚及反式白藜芦醇的含量，其中 CXB-11（黑孢属Nigrospora sp.）和 CXC-13（镰孢属Fusarium sp.）的作用尤为显著 (Scali et al. 2016)。从A. arborescens中检测到的代谢物种类最多，包括有机酸（如咖啡酸、丁香酸和没食子酸）、原花青素、黄烷醇（如芦丁、

  山柰酚和槲皮素）和黄烷-3-醇（如表儿茶素、表没食子儿茶素和儿茶素） (Pan et al. 2020)。从赤霞珠葡萄中分离出的各种内生丝状真菌菌株（如曲霉属Epicoccum sp. RH37、链格孢属 Alternaria sp. RH6、链格孢属Alternaria sp. RH32 和单端孢属Trichothecium sp. RH34）证明，它们会对葡萄中的总糖、可溶性蛋白质、总黄酮、总酚和丙二醛的含量产生积极影响 (Yang et al. 2018)。也有研究发现分离出的一些内生丝状真菌（黑曲霉Aspergillus niger C2J6、金色毛壳菌Arcopilus aureus 12VVLPM）具有合成白藜芦醇的能力 (Dwibedi and Saxena. 2018; Liu et al. 2016)。这些内生丝状真菌有助于积累各种多酚物质，使葡萄浆果具有丰富的保健功效和感官特性。此外，内生丝状真菌和其合成的酚类物质随着葡萄浆果进入发酵环境，也会影响葡萄酒的颜色。Chen et al. (2020)的研究表明，将葡萄浆果与从葡萄叶中分离出来的内生真菌共培养，可显著提高葡萄细胞中花青素的浓度。利用这种内生丝状真菌可以有效调节葡萄酒的颜色。然而，内生丝状真菌对颜色的作用也不总是积极的，因为其代谢产物不稳定，经过几代后其生物特性会变差 (Nan et al. 2018)，导致葡萄酒颜色严重退化。如何控制内生丝状真菌尽可能发挥其积极的一面，还有待进一步研究。

  3 内生丝状真菌对葡萄酒香气的影响

  全球各葡萄酒产区生态气候特征独特，内生菌菌群复杂多样，引起了葡萄酒颜色丰富多变的同时，也引起了葡萄酒其它风味成分的变化（南立军等 2018）。研究表明真菌对葡萄酒香气的贡献很大，葡萄汁中的真菌多样性和葡萄园土壤中的真菌多样性均对葡萄酒香气产生积极影响 (Liu et al. 2020)。其可能的原因是内生丝状真菌产生多种多样丰富的可挥发物质，如醇类物质、酚类和酯类等。A. pullulans中富含淀粉酶和β-葡萄糖苷酶，在发酵早期对葡萄酒中糖基化挥发物如苯乙醇、3-甲基-1-丁醇和辛酸乙酯的产生有积极的贡献 (Wang et al. 2020)。在成品葡萄酒中，曲霉与挥发性化合物如辛酸和癸酸密切相关 (Wei et al. 2022)。还有一些挥发物在发酵过程中与内生丝状真菌的关系非常密切，如1-庚醇和1-辛醇与 Colletotrichum呈正相关，与Alternaria呈负相关等。在黑比诺葡萄酒自发发酵过程中 (Liu et al. 2021)，发现一些内生丝状真菌与挥发性物质具有很强的相关性，例如Didymella negriana 与citronellol、ethyl nonanoate、3-methyl-2-cyclopentenone等物质；Cladosporium ramotenellum 与ethyl hexadecanoate；Aureobasidium pullulans与hexyl 4-hydroxybenzoate。类似的相关性也存在于霞多丽葡萄酒中 (Liu et al. 2021)，例如Cladosporium grevillea与linalool；Epicoccum nigrum与α-terpineol和linalool；A. infectoria与β-damascenone。在维达尔葡萄冰酒自然发酵过程中发现(Chen et al. 2020)，青霉菌与 2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乙醇、乙酸异戊酯和异戊醇等核心挥发性化合物呈正相关 (Chen et al. 2020)。一些化合物的存在会导致葡萄酒产生异味，如子囊菌和担子菌的代谢产物 1-辛烯-3-酮和 1-辛烯-3-醇会导致新鲜蘑菇的异味(Tressl et al. 1982)，Crustomyces subabruptus 也是 1-辛烯-3-酮的重要来源 (Meistermann et al. 2021)。有效控制这类内生丝状真菌可确保葡萄酒远离新蘑菇异味。总之，内生丝状真菌对酿造出具有产区特色风味的葡萄酒以及改善葡萄酒香气具有重要意义。

  4 内生丝状真菌在葡萄酒中的应用

  内生丝状真菌作为长期与葡萄共存的微生物类群，具有一定的安全特性，且他们对葡萄酒颜色、香气、口感等方面具有卓越的贡献。将此类微生物应用于酿酒过程中可以减少外源添加物的添加，是一种低成本、操作可控的工艺技术。适当的混合发酵是酿酒行业中改善葡萄酒香气和风味，提高葡萄酒品质的主要途径。另外，固定化酿酒酵母技术有利于适应酒精发酵的微环境，广泛应用于酿酒领域。使用丝状真菌对酵母进行固定化的技术叫“酵母生物胶囊”。近年来有研究报道使用丝状真菌（如：青霉属、曲霉属、根霉属）作为酿酒酵母的固定化材料，代替原来的物理化学材料，如使用 A. oryzae作为固定化材料生产得到的雪利酒被发现具有更高的感官得评分 (Ogawa et al. 2019; Ogawa et al. 2022)。此外，内生丝状真菌的优良品质展现出了葡萄质量管理的潜力，可以将其开发为特定功能菌剂，反接种到葡萄植株上，以最大限度地发挥内生丝状真菌的作用。将从葡萄中分离出来的某些优良内生丝状真菌反向侵染到酿酒葡萄上，可以明显提高葡萄的可滴定酸度(Yang et al. 2018)，这对改善全球变暖导致成熟葡萄浆果“糖高酸低”的情况具有积极作用，是提高我国西北产区原料质量的一种可行性手段。此外，反侵染技术也可能影响酿酒葡萄的代谢谱，产生新型代谢物 (Huang et al. 2018)。这些代谢物能够随葡萄进入酿造环境，进一步改善葡萄酒品质。

  丝状真菌一般富含多种酶如β-葡萄糖苷酶、葡聚糖酶和淀粉酶等 (Blattel et al. 2009; Lu et al. 2024; Picart et al. 2016)。β-葡萄糖苷酶是葡萄酒酿造过程中的关键酶之一，它参与连接到末端非还原性糖苷和寡糖的糖苷键的水解和葡萄糖苷元的释放，使葡萄酒具有品种香气特征 (Zhang et al. 2021)。葡聚糖酶用于降解真菌细胞壁中的主要成分葡聚糖，一方面用于改善受灰霉菌感染的葡萄所酿的酒(Enrique et al. 2010)，一方面促使酵母自溶，释放一些自溶物质以改善葡萄酒的风味和复杂性。溶菌酶能够水解细菌细胞壁黏多糖，在苹乳发酵之前或结束后预防细菌腐败 (Liburdi et al. 2014)，不仅可以保障葡萄酒良好的感官品质，还能提升葡萄酒的卫生健康质量。因此内生丝状真菌可以为挖掘或者开发具有更好活性或者特性的这些功能酶提供新的微生物资源，并且可以制备成酶制剂应用于葡萄酒发酵。