蓝莓种质资源鉴定与新种质创制岗

徐艺格 魏鑫 王兴东 刘有春 杨玉春 刘成

  越橘是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）植物，一般被称为蓝莓、蓝浆果（Blueberry）、乌饭树、南烛等。全世界越橘属植物约有400个种，广泛分布于北半球，从北极至热带高山、河谷、沿海地区均有分布，其中有40%的种分布在东南亚地区、25%的种分布在北美地区、其中10%的种分布在美国的南部或中部地区。我国占全球越橘属植物的20.22%，约有91个种28个变种，分布于我国东北和西南地区，其开发利用还处于初步阶段，多处于野生状态。现栽培越橘品种多从国外引进，作为经济价值相对较高的灌木，我国已实现高寒地区日光温室栽培、多雨地区避雨栽培、暖温带简易设施栽培模式，产业发展极快。根据2023年IBO数据（http://www.THEIBO.org），全球高丛越橘栽培面积达24.85万hm2，我国栽培面积占全球的31.22%，为7.76万hm2，居世界首位。

  近几年，栽培越橘的种植模式从粗放化、零散化向产业化、规模化方向发展，其资源的引进收集、种质创新以及高效丰产栽培措施的推广为产业发展提供了更优质的种苗和技术。另外，对蓝莓生理生化、遗传生物学等基础科学的研究同样也带动了产业发展。本文对我国越橘引种适栽及种质创新、资源鉴定评价、遗传多样性研究进展进行整理概括分析，以期为该项产业技术研究和发展提供信息、理论和技术参考。

  1 不同产区主要栽培品种情况

  我国主栽地区大致可划分为5个产区：黑龙江省大小兴安岭、吉林省长白山及辽宁沈阳以北地区为寒带森林地区，该产区无霜期110～150 d；以丹东、大连为主的辽东半岛和以辽西葫芦岛新兴产区为辅组成的温室蓝莓产区，以微酸性砂壤土为主，属温带大陆性季风气候区，无霜期为160～180 d；以山东半岛组成的露地或简易设施产区，无霜期180～260 d；以上海、江苏、浙江、湖北等长江流域一带组成的避雨栽培产区，无霜期190～280 d；以云南省、贵州省和西藏等高海拔地区为主的高海拔山地蓝莓产区，此地区无霜期从190 d（丽江）到351 d（临沧）不等。同一品种在不同产区的采收期存在差异，辽宁地区的南高丛品种可以较快满足需冷量，利用温室升温可以较山东露地或简易塑料大棚栽培提早上市（表1）[3-10]。西南产区特别是云南地区利用高海拔气候优势和多种栽培品种类型实现基本全年采收。

  2  越橘属种质鉴定评价

  广泛的资源收集对越橘属植物的研究及产业长久发展具有重大意义，而种质资源鉴定以及准确的记录是收集资源后重要的一环。种质鉴定主要包括植物学性状、生物学特性、抗逆性及重要性状基因挖掘与鉴定等。

  2.1 植物学性状鉴定

  植物外观的描述和记录是评判品种最直观的方法。果树的叶片性状、果实性状可以代表品种的特征，是研究品种亲缘关系的基础，也可作为栽培品种推广和适用性的理论依据。刘艺等通过测定果实颜色、花色苷单体、花青素、总酚、总黄酮和多糖含量等13个指标，探讨各指标间的相关性，结果表明，主成分分析与聚类分析法可实现对蓝莓品种准确高效的综合评价。乌凤章等认为单果质量、果形指数、可溶性糖质量分数、可滴定酸质量分数、花色苷质量分数和果实硬度这6项可作为评价果实品质的代表性指标，他利用主成分分析及方差分析法，综合评价出排名前10位的蓝莓品种，依次为大果蓝金、莱格西、杜克、日出、维口、蓝片、早蓝、蓝丰、爱国者、红利，这可为大连地区选择及推广蓝莓主栽品种提供理论依据。刘丙花等筛选出可综合评价蓝莓果实质地品质的3个核心指标：果实硬度、果皮脆性和果实回复性。蓝莓果实质地优良的参评品种结果依次为大粒蓝金、克瑞顿、布莱登、陶柔、夏普蓝、莱格西、奥尼尔、泽西、米德、双迪。谢国芳等发现采收时间对不同产地和不同品种蓝莓果实品质的影响存在较大差异。张瑜瑜等对云南地区栽培的6个蓝莓品种进行抗氧化性和可滴定酸评价，其中比洛克西可滴定酸含量最高，抗氧化性较其他5个品种强，认为在云南主产区比洛克西更适用于深加工，从而获得更高的经济效益。

  为解决宁波地区蓝莓鲜食品种抗病性差、树势易衰老等问题，朱宏芬等分析了高丛蓝莓及兔眼蓝莓的植物学性状和果实性状，筛选出适于鲜食的6个品种，分别为高丛品种明星、瑞贝尔、甜心和兔眼品种奥克尼、泰坦、芭尔德温。Wang等利用超高效液相色谱法测定了62个品种的花青素成分，研究鉴定出5种类型的30种花青素成分（表2），并发现茹贝尔的花青素含量最高，为5 341.8 mg/kg FW，而普鲁的花青素含量最低，为717.34 mg/kg FW，其中飞燕草素-葡萄糖苷[delphinidin（Dp）-glycoside（gly）]是主要成分。付燕等利用物性分析仪测定了8个蓝莓品种的果实质地品质，通过综合评价果实硬度、果皮脆性、果实回复性和果实弹性4个核心指标以及TPA评价，结果发现果实硬度与果实弹性呈极显著正相关，参试的8个品种中顶峰、绿宝石和灿烂的果实硬度分别为4.70 N、4.49 N和4.06 N，综合评价指数分别为0.504、0.440和0.666，认为上述3个品种的果实相较其余5个品种更耐贮运，可以考虑作为输送长距离市场的备选品种以及耐贮运品种培育的备选亲本。

  2.2 抗逆性鉴定

  中国独特的自然条件，对国外引进品种的种植具有一定的挑战性。由于越橘根系多为须根（无主根）且对土壤pH条件要求较为严格，因此开展其抗逆性研究是保证品种适地适栽和良种繁育的重要前提。研究发现，兔眼蓝莓受到短期干旱胁迫时，通过提高超氧化物歧化酶（SOD）活性来降低活性氧带来的伤害，随着干旱持续，蓝莓则启动渗透调节系统并积累渗透调节物质以抵御逆境。王明月等研究发现，外施400μmol/L硝普钠(SNP)对缓解中度干旱胁迫下越橘生长所受伤害的效果最好。外源6-BA也对干旱胁迫下的蓝莓有保护作用，6-BA预处理可提高渗透调节物质——脯氨酸的含量并且增加脱落酸分泌量，形成气孔关闭保护机制。魏鑫等利用低温胁迫下蓝莓枝条验证了过氧化物酶（POD)、过氧化氢酶（CAT）和SOD活性较高的品种美登具有较强的抗寒性。刘炳含等研究发现外源水杨酸（SA）可以有效缓解休眠期越橘所受到的低温伤害。

  高土壤pH胁迫抑制蓝莓生长，体内丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白含量在叶片中增加。此外，在所有品种中抗氧化系统里CAT活性增强，而SOD活性降低。周双等分析了不同蓝莓品种在高pH培养基中培养后增殖系数和株高的相关性，建立了鉴定蓝莓耐高pH培养基能力的回归方程。乌凤章研究发现，蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、株高相对生长量、电子转移速率（ETR）、CAT活性和叶绿素含量可作为鉴定北高丛蓝莓品种耐较高土壤pH胁迫能力的关键指标。植株表型相关数据的测量及分析有利于后续抗逆基因的挖掘研究。

  目前国内外越橘病原菌种类繁多，常采用观察菌落形态及产孢情况的形态学鉴定和基于系统发育树分析基因测序结果的分子生物学鉴定二者结合的方法鉴定病原菌种类。李媛等和康海婷等对蓝莓的茎溃疡和枝干溃疡病的致病菌进行形态学和分子生物学鉴定，发现茎溃疡的致病菌为Diaporthe hongkongensis，枝干溃疡病的致病菌为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。越橘采后果实病害及保鲜技术也是抗病性研究的热点之一，由松针刺盘孢菌引起的高丛蓝莓炭疽果腐病，在果实发育期病菌处于潜伏期、不易检测，但采后不当保存条件下果腐病易发生，预估损失高达100%。Miles等试验结果表明，子代对炭疽病抗性与亲本的易感性密切相关，遗传力（H2）介于63%～73%之间。因此，采用QTL定位或分子标记技术鉴定有助于发掘蓝莓抗炭疽果腐病的相关基因位点，预测品种或品系的抗性，促进在早期蓝莓育种和选育工作中对炭疽病果腐病抗性的筛选。茉莉酸甲酯（MeJA）通过调节抗氧化酶的活性，并激活苯基丙烷代谢途径来增强蓝莓对灰霉菌的抗性。Yan等通过代谢组学分析表明，MeJA通过促进苯丙氨酸代谢物的积累和诱导糖酵解途径、TCA循环，来提供足够的能量，降低蓝莓果实对灰霉菌的敏感性。可见，从代谢组学角度分析蓝莓感染病菌后各代谢途径产物的差异，可为制定新的防控策略提供依据。

  2.3 重要性状基因功能鉴定

  从基因水平找到果实经济性状的调控基因是目前的研究热点，通过生物信息学等方法鉴定基因的表达方式，以期找到相关调控基因，可提升越橘资源价值。李天杰等采用生物信息学方法鉴定蓝莓GolS基因家族成员，使用qRT-PCR技术分析VcGolS在不同组织和非生物胁迫下的表达模式，发现VcGolS基因启动子中含有大量植物生长发育、激素响应和非生物胁迫响应顺式作用元件。

  研究表明，碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLHs）和MYB转录因子参与到植物花青素的积累过程，对果皮、果肉、叶片和花器官等各种颜色的形成具有重要作用。Zhang等通过同源蛋白序列比对，从蓝莓基因组数据中发现了6个与花青素生物合成相关的基因，分别为bHLHs、VcAN1、VcbHLH42-1、VcbHLH42-2、VcbHLH42-3、VcbHLH1-1和VcbHLH1-2，qRT-PCR结果表明，VcAN1表达量随着蓝莓果实的成熟而增加，推测VcAN1可能是控制蓝莓花青素生物合成的关键基因。Zhang等鉴定了15种候选花青素生物合成相关MYB（ABRM）蛋白，发现花青素的积累和MYBs的表达受到许多因素的显著影响，如光、ABA和JA。Wang等鉴定了249个MADS-box基因，其中VcMADS6、VcMADS35、VcMADS44、VcMADS58、VcMADS125、VcMADS188和VcMADS212在蓝莓果实成熟过程中具有潜在的功能。

  3 种质资源遗传多样性研究

  推进越橘属种质资源遗传多样性研究有助于了解其遗传结构、遗传背景和品种间的遗传关系，为未来越橘种质资源创新利用、新品种选育、分子标记辅助育种等方面提供参考，为合理严密制定资源创新研究计划提供理论依据。基于形态学标记和分子标记方面开展了较为丰富的越橘种质资源遗传多样性研究。

  3.1 基于形态学性状的越橘遗传多样性研究

  形态学标记在作物分类和育种上发挥着重要作用。通过形态和表型特征对遗传变异进行识别是一种简单、传统的方法。这一般指植物的外观形态特点，如株高、株型、叶色、叶形、叶长、花形、花色、果粉、果蒂痕等，系可通过视觉观察或仪器直接测量的性状特征。李伟等明确了吉林、山东两地40个蓝莓品种的表型多样性与亲缘关系，指出培育蓝莓新品种选择亲本时，树势、株型、株高、冠径、果实硬度、果粉等表型性状在遗传过程中父母本与后代的相关性较强。朱思佳以74份越橘种质资源为材料，调查并分析其物候期、植物学性状和果实性状，发现花冠高度和口径、叶柄长度与果实横径、果实体积、萼洼直径呈极显著正相关，叶片纵径、叶面积与萼洼直径呈极显著正相关，叶形指数与果肉质地呈极显著正相关。

  对于形态学特征研究是一种直观的品种与品种、品种与杂交后代建立联系的方法。由于形态学分析易受到环境和基因显隐性的影响，在应用过程中具有一定的局限性。基因之间在遗传过程中存在着表达、调控和个体发育等多个复杂过程，如何将表型与基因型紧密联系起来是研究的关键。

  3.2 基于分子标记的越橘遗传多样性研究

  分子标记可分为随机DNA分子标记类型（例如简单重复序列标记SSR）、目的基因分子标记与功能性分子标记类型(例如序列特异扩增多态性SSAP、相关序列扩增多态性SRAP、单核苷酸多态性SNP）。SSR分子标记技术和聚类分析方法将亲缘关系相近的品种聚成一类，有利于种质资源的创新、亲本的选择和品种鉴定的发展。王利平等利用25对蓝莓SSR引物对17份试材的遗传多样性进行评价，结果参试资源被分成4类，其中超大果型蓝莓优瑞卡与其他资源亲缘关系较远。张春红等将设计合成的多态性好的引物用于66份蓝莓不同类型种质的遗传多样性分析，发现聚类分析结果与品种的遗传成分有一定的相关性，其自育品种与亲本大果蓝金遗传距离相近，证明了它们间的亲缘关系。

  方茜基于SSR和SSAP两种分子标记方法鉴定52份越橘属资源，并对其进行亲缘关系分析，综合SSR和SSAP的鉴定结果推测兔眼越橘贵蓝和波尼塔具有高丛越橘（Vaccinium corymbosum L）血缘。Li等使用链特异性RNA测序（ssRNA-Seq）对南高丛蓝莓中的lncRNA进行了全基因组鉴定，对果实发育4个阶段的lncRNA差异表达及其潜在靶基因进行了分析，发现lncRNA可能会在果实膨大和成熟中存在潜在作用，一些lncRNA被认为是类黄酮生物合成的关键基因的顺式调控因子。Zong等利用主坐标分析对48个蓝莓品种的SSAP基因型数据进行了亲缘关系分析，48个品种可分为5组，参试品种的遗传背景相对简单，高丛蓝莓品种的遗传位置相似，由单一的基因库组成，选择遗传距离较远的品种进行杂交将丰富蓝莓的遗传多样性。

  4 越橘种质资源创新

  资源的收集保存是种质资源创新与利用的重要前提条件，为了更好地保护和利用越橘属种质资源，国家制定了《越橘种质资源描述规范和数据标准》。该标准有利于整合全国越橘种质资源，规范越橘种质资源的收集、整理和保存等基础性工作，创造良好的资源和信息共享环境和条件；充分挖掘其潜在的经济、社会和生态价值，能够促进全国越橘种质资源研究的有序和高效发展。

  育种是进行种质资源创新的常规方法。辽宁省农业科学院、辽宁省果树科学研究所自20世纪80年代初开始通过出国考察、合作交流等途径收集蓝莓资源并进行试验研究，是最早开展蓝莓商业化栽培的省份之一，也是最早尝试将需冷量低、果个大、成熟早、品质优的南高丛蓝莓品种栽植于日光温室的地区，吉林、浙江、广西[58]等地的研究单位也一直进行本地区蓝莓资源的收集与保存工作。

  前人报道和国家林业和草原局公告（https://www.forestry.gov.cn）显示，全球育成的高丛蓝莓以鲜食蓝莓为主，2018—2023年间不同育种单位以适应本地区栽培条件、高产量、耐储运、抗病育种为目标，共公布或获得新品种授权高丛品种302个，育成国家包括美国、中国、新西兰、澳大利亚、日本、荷兰、加拿大和西班牙共8个国家，其中美国占比26.16%，中国占比23.84%，澳大利亚占比11.92%。国内主要蓝莓育成（获得新品种权）单位有山东省果树研究所（蓝冠、蓝珠、蓝月、蓝玲）、大连森茂现代农业有限公司和大连大学（启明星、晨雁、森茂系列等）、辽宁省果树科学研究所（辽蓝513、辽蓝515）、浙江蓝美技术股份有限公司（蓝美88和蓝美119）、江苏省中国科学院植物研究所（寨选4号和寨选7号）、中国科学院植物研究所（蓝闺蜜）和通化禾韵现代农业股份有限公司（蓝星、蓝韵），其中晨雁和辽蓝513果实带有香气。

  5  展望

  5.1 加强野生资源收集保存和驯化

  近年来，针对所在地区的越橘野生资源的种类、分布特点、典型生境等进行了调查、驯化栽培工作，但对于越橘资源的植物学、生态学、遗传学、生化等方面的研究较少。臭越橘（Vaccinium foetidissimum Levl. et Van）是我国特有的杜鹃花科越橘属常绿灌木，特产于我国贵州南部，其研究仅限于1907年采集到的果期标本和2021年调查完善的花部形态特征，鲜有后续研究。笃斯越橘（Vaccinium uliginosum L.）、乌饭树（Vaccinium bracteatum）、红果越橘（Vaccinium koreanum Nakai）等在我国原产地区均有食用或药用记录，其它越橘属植物也具有一些优良性状，例如良好适地性，今后将这些具有优良性状的本地资源通过栽培或者杂交育种利用起来，以增加常栽越橘资源变异范围，解决遗传基础狭窄的问题，对产业的进一步发展可起到良好的推动作用。

  5.2 加强越橘成花及果实发育机理方面研究

  未来越橘研究方向需侧重于成花或抑花基因的挖掘。目前有研究表明蓝莓花芽分化过程中高浓度ABA、GA（赤霉素）会造成南高丛蓝莓品种存在二次成花或多次成花的现象，但诱导植物开花的基因LFY和AP1的调控机理并不清晰。蓝莓花序为总状花序，通常5～10朵花自下而上（以离枝干远端为下）依次着生于花柄，花柄长于花轴上，整个花轴上每朵花发育程度不同，下端花朵发育较早、果实成熟也较早。因此，蓝莓栽培品种普遍存在果实成熟期不一致的现象。目前对于花期同步、花序花朵数量基因的调控研究较少，今后可利用花期较为同步的高丛蓝莓品种进行资源创新，再结合配套栽培技术实现“串枝”果生产，为栽培生产中减少人工成本提供优质种质资源。

  5.3 加强组学技术在越橘性状形成基因调控方面的研究

  以往对广泛栽培的高丛蓝莓、兔眼蓝莓品质性状表达、营养性状表达、种间差异性的遗传机制等方面研究较为缓慢，需要运用基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等技术来加快这一进程，以满足消费者日益增长的需求和不断变化的偏好。组学技术利用基因、蛋白质等在分子水平上解释品质性状表达、营养性状表达、种间差异性、抗病性等发生的原因。Wu等公开了首个越橘属非栽培品种——欧洲越橘（Vaccinium myrtillus L.）基因组的组装结果，包括利用牛津纳米孔（ONT）和Hi-C技术组装的12条假染色体；通过去除重复序列而描述了决定花青素表达量的关键调控基因MYB。该结果表明，欧洲越橘和高丛越橘之间的关键性状（果实和果皮颜色）所涉及的基因座是高度同源保守的。未来的研究重点在于利用组学技术分析环境、修剪等外界因素在商品性状、果实表皮细胞代谢、植株抗病性等方面的作用机理以及品种间性状表达的遗传机制，促进日后的种质创新利用及产业发展。