病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 原青云

  灰比诺葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus, GPGV）首次于2012年在意大利北部的灰比诺葡萄中被发现。有研究通过对GPGV的基因组序列进行系统发育分析，表明该病毒起源于中国。目前，法国、美国、中国、加拿大、德国和日本等五大洲的58个国家均已报道GPGV侵染葡萄。我国在2015年通过RT-PCR检测首次发现 GPGV，且广泛应用的葡萄抗寒砧木“贝达”受GPGV侵染后症状明显。GPGV在我国葡萄上普遍发生，检出率达28.2%（55/196）。GPGV是葡萄叶萎蔫和变形（grapevine leaf mottling and deformation，GLMD）的致病因子，导致葡萄叶片斑驳、皱缩和变形，引起长势减弱、果实酸度增高、坐果减少和成熟不均匀等危害。目前，中国GPGV分离物的基因组全长序列尚不多见，本研究对表现褪绿斑驳症状的贝达葡萄进行小RNA测序，并结合PCR和RACE扩增获得了GPGV中国分离物C12B的基因组全长序列。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  葡萄样品为辽宁省葫芦岛市兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心试材保存圃栽植的‘贝达’葡萄， 表现褪绿斑驳症状。

  1.2 试验方法

  （1）小RNA测序及分析

  将采集的葡萄叶片通过干冰运输至北京百迈客生物科技有限公司，委托其对叶片组织中的小RNA进行深测序。原始数据过滤、小RNA组装及Blast比对按照已报道的方法进行。

  （2）RNA提取及反转录

  剪取适量的‘贝达’葡萄品种嫩叶，采用柱式RNA提取法进行总RNA提取。反转录在1.5 ml灭菌离心管中进行，依次加入18.0 μl RNase free water、6 bp Random Primer 2.0 μl、总RNA 10.0 μl，离心混匀，72 ℃金属浴7 min，加入5×M-MLV buffer 10.0 μl、10 mmol/L dNTPs 6.0 μl、200 U/μl M-MLV 逆转录酶1.0 μl、灭菌纯水3.0 μl，37 ℃金属浴10 min，42 ℃金属浴50 min，72 ℃金属浴10 min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或-20℃冰箱保存。

  （3）GPGV全长基因组扩增及克隆、测序

  根据小RNA拼接获得的GPGV序列设计引物，分段扩增GPGV全长基因组序列。采用RACE方法对GPGV的5ʹ和3ʹ端非编码序列进行扩增。对PCR扩增获得的目的DNA片段经艾德莱生物公司提供的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收纯化后，与POTO-T载体室温连接5 min，转入Escherichia coli DH5ɑ感受态细胞，挑取白色单克隆菌进行菌液培养，经PCR验证后获得阳性克隆并提交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

  （4）序列分析

  利用DNAStar软件进行序列拼接，利用DNA-MAN软件分别对LN_BETA2、LN_CXZ与GenBank中已公布的GPGV其他分离物进行核苷酸和氨基酸序列相似性比较。利用NCBI在线工具CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对获得的GPGV基因组结构进行分析。基于GPGV中国分离物C12B1与GenBank中已公布的GPGV其他分离物的多聚蛋白（polyprotein）序列，采用MEGA11软件构建系统进化树，构建方法是邻接法（neighbor-joining，NJ），置信值（BootStrap）设为1000 。同时利用MEGA7.0软件中的Kimura2-parameter (K2P) 法来计算各组内和组间的遗传距离。

  2 结果与分析

  2.1 小RNA测序

  对叶片表现褪绿斑驳症状的贝达葡萄进行小RNA测序，结果显示，贝达葡萄测序分别得到了17,964,655原始测序数据。对原始测序数据进行过滤处理，贝达和蛇龙珠分别得到15,825,017处理后数据。

  通过Velvet软件拼接处理后的数据，将获得的contigs片段与NCBI的病毒数据库进行比对。结果表明，在贝达葡萄中鉴定出了2种葡萄病毒和4种类病毒，分别为GRsPaV、GPGV、啤酒花矮化类病毒（hop stunt viroid, HSVd）、澳大利亚葡萄类病毒（australian grapevine viroid, AGVd）、葡萄黄斑类病毒1（Grapevine yellow speckle viroid 1, GYSVd1）和葡萄黄斑类病毒2（Grapevine yellow speckle viroid2, GYSVd2）。其中有18个contigs与葡萄GPGV分离物（FR877530）的基因组序列核酸一致性为93.02%~100%。覆盖率为94.8%。

  2.2 基因组结构分析

  依据小RNA拼接获得的GPGV的基因组的contigs序列分别设计引物，采用RT-PCR和RACE技术分别扩增贝达和蛇龙珠葡萄的cDNA，最终获得GPGV中国分离物的基因组全长序列，命名为C12B1。其中，C12B1的基因组全长序列已提交GenBank数据库，登录号为PP623117。C12B1基因组全长7259 nt，其3'和5'的非编码区（UTR）长度均为82 nt和104 nt。其基因组均由3个重叠的ORFs组成，与已报道的GPGV基因组结构一致。其中，ORF1编码一个1855 aa的多功能蛋白，该蛋白包含了4个保守功能域，分别为病毒甲基转移酶（methyltransferases）、2OG-Fell-Oxy加氧酶结构域（20G-Fell-Oxysuperfamily）、病毒RNA解旋酶（Viral helicase）和RNA依赖型的RNA聚合酶（RdRp）。ORF2和ORF3分别编码了375 aa的运动蛋白（MP）和195 aa的外壳蛋白（CP）（图1）。

  2.3 同源性分析

  运用Geneious Prime软件，将获得的C12B1分离物的序列与GenBank中登录的186个GPGV分离物的基因组全长序列进行同源性分析，结果表明，C12B1与其它GPGV分离物的基因组全长序列的核苷酸一致性分别为79.13%-97.52%。C12B1与其它GPGV分离物的RdRP基因核苷酸一致性分别为78.59%-97.66%，氨基酸一致性分别为87.67%-99.19%。C12B1与其它GPGV分离物的MP基因的核苷酸一致性分别为80.76%- 97.43%，氨基酸一致性分别为86.44%-97.87%。C12B1与其它GPGV分离物的CP基因的核苷酸一致性分别为92.31%-98.97%，氨基酸一致性分别为和92.31%-99.49%。

  2.4 进化树分析

  利用MEGA11软件对188条GPGV全长序列进行系统发育分析并构建系统进化树，进化树被划分为3个主要组群，组群4又被划分为5个亚组，即3a~3e。其中，大部分分离物被划分到第3组群中，C12B1分离物被划分在亚组3a（图2）。