土壤和产地污染管控与修复岗位
摘要：镉对葡萄的生长、发育和品质都会造成严重影响，果园受到的低浓度镉污染问题不容忽视，砧木嫁接能够提高葡萄对镉胁迫的适应能力，但关于镉胁迫下砧木嫁接对葡萄植株影响的研究较少。本研究以三种不同砧木嫁接的阳光玫瑰葡萄的二年生苗为试材，用不同浓度的镉处理土壤，研究了镉胁迫下三种砧穗组合叶片的抗氧化系统的变化。不同砧穗组合对镉的吸收及体内抗氧化物质含量不尽相同。SM/SO4组合叶片镉含量残留最少，SM/3309C组合叶片镉含量残留最多。在生理水平上，低镉可能激活其抗氧化系统。三种砧穗组合在低镉胁迫下，过氧化氢和丙二醛含量都随镉浓度的增加呈先降低后增加的趋势；脯氨酸和总叶绿素含量，基本随镉浓度的增加而增加；SOD和GR活性也基本随镉浓度的增加而增强，并且SM/SO4和SM/5BB两个组合的变化趋势更为一致。镉对高等植物暂无有益作用，低镉胁迫激活了葡萄植株的抗氧化系统。上述发现有助于了解嫁接阳光玫瑰葡萄在低镉胁迫下的响应机制，为进一步明确葡萄植株对镉的吸收及其调控机制，提供理论参考。同时为生产中阳光玫瑰葡萄砧木选择、改良葡萄品质提供理论支撑。
1 引言
葡萄具有极高的经济价值，既可作为鲜食果品，也可用于加工，如葡萄干、葡萄汁和葡萄酒等，是世界上最古老和种植最广泛的果树之一。近几年来，随着人们生活水平不断提高，我国对鲜食葡萄的需求也在逐年上升，年消费量保持在1000万吨左右。阳光玫瑰葡萄是由日本选育而成的中晚熟鲜食葡萄品种,因其浓郁的香味，高糖含量，酸度较低,成为亚洲国家人们最受欢迎的鲜食葡萄。
镉对于植物来说是非必需的生理元素。与其他重金属相比，Cd是一种相对可移动的元素，极易被植物根系吸收和转运，即使很低浓度的Cd也会对生物体造成危害（Chen and Kao, 1995）。Yang等(2018)调查发现，36.7%的土壤样品中Cd浓度超出了中国土壤环境质量标准(GB15618-1995)的II级值(0.3 mg/kg)。因此，研究植物如何应对镉胁迫是十分必要的。李小红（2018）发现嫁接可以提高矢富罗莎葡萄植株对Cd胁迫的耐受性，但葡萄植株对Cd胁迫的响应机制不仅与Cd处理的浓度和时间相关，还与品种密切相关，而Cd对阳光玫瑰鲜食葡萄的影响，还未见报道，同时，不同砧木嫁接阳光玫瑰葡萄对Cd的富集和抗性特点、嫁接后阳光玫瑰葡萄在Cd胁迫下的生理生化反应以及转录和代谢水平的变化，尚不清楚。
因此，本试验以三种不同砧木（生产常用）嫁接的阳光玫瑰葡萄为试验材料，用不同浓度的Cd处理土壤，研究Cd胁迫对葡萄生理生化指标、抗氧化系统的影响；通过比较三种不同砧木对Cd的耐受性，以及Cd处理后葡萄叶片的Cd积累，了解不同砧木对葡萄Cd吸收的影响。上述研究可为生产上通过选择适宜的砧木、减少重金属危害、促进优质葡萄生产，提供理论支撑。
2 材料和方法
2.1 试验材料
本研究中使用的葡萄材料为嫁接一致的一年生阳光玫瑰，所选的砧木品种分别为SO4、5BB和3309C三种常见的阳光玫瑰砧木品种，嫁接苗采用简写形式分别为SM/SO4、SM/5BB和SM/3309C。
葡萄园土过筛，每盆称重20kg，将CdCl2按需换算为Cd浓度梯度。Cd浓度梯度为0 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.8 mg/kg、1.6 mg/kg、3.2 mg/kg，后将每盆所需CdCl2溶于500 ml蒸馏水，边铺土边喷含Cd溶液，最后搅拌3-5次，保证充分混匀。每个Cd浓度处理的每种砧木设置3个生物学重复，以0 mg/kg的为对照组，共计54盆。定植28天后，待叶片长到6-8片叶时，取长势好、成熟、完整的葡萄叶片于12 小时收集样品，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱，用于后续分析。
2.2 试验方法
称取0.2g葡萄叶片样品于坩埚中，加入8ml浓硝酸，2ml高氯酸，放置过夜，次日将电热板设置到180℃进行消煮至剩余1ml液体后用蒸馏水洗涤坩埚，定容至25ml，用定量滤纸过滤后用ICP-OES测定。
按照南京建成生物技术有限公司提供的试剂盒指示的方法进行叶片H2O2含量和GR活性测定。
硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛（MDA）含量，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮显色法。（李合生，2000）。
叶绿素（Chl）测定采用95%乙醇研磨-过滤法。
超氧化物歧化酶（SOD）采用NBT法测定（Beauchamp and Fridovich, 1971）。
果实粒纵与粒横测定：从果穗上中下部位采摘共15粒果实，使用游标卡尺精确测量。
果实硬度测定：将葡萄果实去掉部分果皮，使用硬度计测定果实硬度。
果实pH测定：将葡萄果实挤出汁液，使用pH计测定果实pH值。
可溶性固形物测定：将葡萄的果肉用榨汁机破碎，用纱布将果汁过滤到烧杯中，用手持折光仪检测葡萄果肉的可溶性固形物含量。
可滴定酸测定：葡萄果肉榨汁，用薄纱过滤。使用酸碱滴定法，加入0.1 mol/L 的NaOH，待出现微红色且30秒不褪色，记录消耗的NaOH的量。
3.结果与分析
3.1 三种砧穗组合叶片镉含量分析
由图3-1A可知，阳光玫瑰叶片镉含量基本随镉浓度的升高而升高，三种砧穗组合（SM/SO4、SM/5BB和SM/3309C）在3.2 mg/kg镉胁迫下叶片镉含量达到峰值，分别为0.38mg/kg、0.75mg/kg、0.76mg/kg。三种砧穗组合均在0.8mg/kg镉胁迫后，变化幅度增大，且在0.8mg/kg、1.6 mg/kg、3.2 mg/kg镉胁迫之间均有显著差异。三种砧穗组合相比，SM/SO4在各浓度胁迫时叶片镉含量最少，SM/3309C叶片镉含量最多。接穗叶片中不同的Cd含量，说明了不同的砧木对Cd的固定不同，相比之下， SO4砧木的根系固定了较多的Cd，而3309C根系固定的Cd较少（图3-1B）。
3.2 三种砧穗组合抗氧化与果实品质相关指标分析
3.2.1 镉胁迫下H2O2含量
阳光玫瑰叶片过氧化氢含量变化基本呈U型趋势，随着镉浓度的升高，H2O2含量先减少后增加，SM/SO4组H2O2含量在61.06～66.66mmol/g，SM/5BB组H2O2含量在58.65～66.03 mmol/g，SM/3309C组H2O2含量在55.57～72.44mmol/g。在每种砧穗组合中，对照组H2O2含量基本高于处理组，表明低镉降低了活性氧的累积（图3-2A）。三种砧穗组合相比，SM/SO4与SM/5BB仅在0.4mg/kg镉胁迫时有显著差异，SM/3309C组与他们差异较大，说明SM/SO4与SM/5BB镉胁迫下H2O2含量变化更为相似（图3-2B）。
3.2.2 镉胁迫下MDA含量
阳光玫瑰叶片丙二醛含量变化基本呈U型趋势，随着镉浓度的升高，MDA含量先减少后增加，SM/SO4组MDA含量在5.87～7.78umol/g，SM/5BB组MDA含量在5.55～8.12umol/g，SM/3309C组MDA在含量6.04～11.59umol/g。在每种砧穗组合中，对照组MDA含量基本高于处理组，表明低镉降低了叶片细胞的氧化损伤（图3-3A）。三种砧穗组合相比，SM/5BB与SM/SO4、SM/3309C仅在0.4mg/kg镉胁迫时有显著差异，SM/3309C与SM/SO4、SM/5BB在0mg/kg、1.6 mg/kg镉胁迫时有显著差异，说明SM/SO4与SM/5BB镉胁迫下MDA含量变化更为相似（图3-3B）。
3.2.3 镉胁迫下Pro含量
阳光玫瑰叶片脯氨酸含量基本随着镉浓度的升高而呈上升趋势。SM/SO4组Pro含量在11.94～31.02ug/g，SM/5BB组Pro含量在9.58～20.63ug/g，SM/3309C组Pro含量在10.96～26.69ug/g。在每种砧穗组合中，对照组Pro含量基本低于处理组，表明叶细胞可能通过提高脯氨酸含量来缓解镉胁迫，且与对照相比，三种砧穗组合均在0.8mg/kg、1.6mg/kg、3.2mg/kg镉胁迫时有显著差异（图3-4A）。三种砧穗组合相比仅在3.2mg/kg镉胁迫时差异显著（图3-4B）。
3.2.4 镉胁迫下Chl含量
阳光玫瑰叶片总叶绿素含量基本随着镉浓度的升高呈上升趋势。SM/SO4组叶绿素含量在0.43～0.50mg/g，SM/5BB组叶绿素含量在0.43～0.54 mg/g，SM/3309C组叶绿素含量在0.44～0.61mg/g。在每种砧穗组合中，对照组Chl含量基本低于处理组，表明低镉在一定程度上促进了叶片叶绿素的合成（图3-5A）。三种砧穗组合相比，SM/SO4与SM/5BB仅在0.8mg/kg镉胁迫时有显著差异， SM/3309C组与他们差异较大，说明SM/SO4与SM/5BB镉胁迫下Chl含量变化较为相似（图3-5B）。
3.2.5 镉胁迫下SOD活性
阳光玫瑰叶片SOD活性基本随镉浓度的升高而呈上升趋势。SM/SO4组SOD活性在7.04～22.51U/g，SM/5BB组SOD活性在6.12～11.24U/g，SM/3309C组SOD活性在19.16～27.26U/g。在每种砧穗组合中，对照组SOD活性基本低于处理组，但1.6mg/kg镉胁迫下SM/SO4组与SM/5BB组均出现降低趋势的拐点（图3-6A）。三种砧穗组合相比，SM/3309C组在各浓度梯度下SOD活性均显著高于其他两组，可能由于其叶片镉含量较多，在低剂量镉胁迫下更有利于提高其SOD活性（图3-6B）。
3.2.6 镉胁迫下GR活性
阳光玫瑰叶片GR活性基本随镉浓度的升高而呈上升趋势。SM/SO4组GR活性在29.41～66.00 U/g，SM/5BB组GR活性在40.05～103.65U/g，SM/3309C组GR活性在35.18～77.44U/g（图3-7A）。三种砧穗组合相比，SM/SO4组GR活性较低，而SM/5BB组GR活性较高（图3-7B）。
3.2.7 镉胁迫下葡萄果实品质分析
由表3-1可知，SM/3309C组在不同浓度镉胁迫下，其果实品质指标存在一定差异。随着胁迫浓度的提高,粒纵和粒横都表现出先增加后减小的趋势。果实硬度和可溶性固形物在0.2mg/kg的镉胁迫下达到峰值，分别为7.13N和15.56°Bri x。固酸比是评判果实感官品质的重要因素，与对照组相比，SM/3309C组在镉胁迫条件下总体呈先增加后减小的趋势，0.4mg/kg的镉胁迫下果实固酸比达到峰值为63.97。
由表3-2可知，3.2mg/kg镉胁迫下三种砧穗组合的粒纵、粒横和硬度之间均没有显著差异。而可溶性固形物和可滴定酸在镉胁迫条件下明显不同，其中，SM/3309C可溶性固形物含量最高，为13.56°Brix，可滴定酸含量最低，为0.29%，可能由于SM/3309C组叶片中含有较多的Cd，在低剂量下促进了果实可溶性固形物的积累，降低了可滴定酸的含量。
4 结论
本研究围绕葡萄在种植中镉污染的基本问题，开展嫁接葡萄响应镉胁迫相关机制研究。利用三种常见砧木嫁接的阳光玫瑰葡萄，对其镉胁迫下的叶片镉含量、抗氧化和果实品质指标进行测定，探究镉胁迫下接穗叶片的抗氧化系统的变化。主要结果如下：
不同砧穗组合对镉的响应和吸收不同。SM/SO4组叶片镉含量最少，SM/3309C组叶片镉含量最多，表明SO4砧木可能更适合于高镉地区选用，因为其根系固定了较多的镉。低镉可能会引起葡萄植株的兴奋效应，低镉胁迫提高了接穗叶片对活性氧的清除能力，降低了叶片的氧化损伤。在生理水平上，三种砧穗组合在低镉胁迫下，其过氧化氢和丙二醛含量都随镉浓度的增加呈先减小后增加的趋势；脯氨酸和叶绿素含量，基本随镉浓度的增加而增加；抗氧化酶SOD和GR也基本随镉浓度的增加而增加，并且发现SM/SO4和SM/5BB变化更相似。
综上所述，可以发现不同砧穗组合对镉的响应和吸收不同，尽管镉对植物是有毒元素，但低镉对植物具有荷尔蒙效应。
