鲜食葡萄品种改良岗位

  一、引言

  葡萄以其丰富的栽培历史、广泛的分布和重要的经济价值而闻名。消费者市场对优质葡萄品种不断增长的需求凸显了育种工作的重要性。不幸的是，杂交育种的效率受到种子休眠和低发芽率固有挑战的严重阻碍。解决漫长的种子休眠期对提高育种效率至关重要。因此，迫切需要一种有效且普遍适用的方法来克服葡萄育种中的种子休眠问题。

  种子休眠表现出各种类型，包括物理休眠、形态休眠和生理休眠。物理休眠源于不透水的种子壳的存在，而形态休眠源于未分化或未发育的种子胚。另一方面，生理休眠是由萌发抑制剂或其他生理因素诱导的。葡萄种子的特点是胚被胚乳包裹，坚硬的种皮包裹在胚乳外侧，完全发育的种子表现出休眠状态。葡萄胚的休眠起始并不主要与胚本身的形态休眠有关。相反，它主要与包裹胚的外周组织诱导的物理和生理休眠有关，具体来说，是种皮和胚乳。

  近年来，冷层积作为一种广泛采用的方法，用于克服种子休眠并提高发芽率。许多研究已经证明了冷层积对各种葡萄品种的种子发芽具有促进作用。另一种广泛采用的促进种子发芽的方法是外源施用赤霉酸（GA3），与冷层级作用一致。例如，Bolt等发现，浸泡在2000至5000 mg/L浓度范围内的外源GA3处理能够破除欧亚葡萄种子的休眠，提高发芽率和发芽的整齐度。此外，Celik观察到，用1500ppm的GA3处理后的lsabella葡萄（美洲种）的种子发芽率达到51.72％。值得注意的是，用赤霉素打破种子休眠的最佳处理浓度因品种而异，需要在葡萄育种中采用量身定制的方法。

  在本研究中，我们通过简单的机械方法成功地获得了大量的种胚，并随后通过裸胚离体培养将它们迅速发芽成苗。这种方法确保了葡萄种子萌发的整齐度和均一性，促进了快速生长，并在幼苗发育上表现出高效率。这种迅速的发芽过程加快了葡萄育种工作的整体进度。这种可行而高效的发芽方法的建立旨在提高葡萄杂交育种和品种选育的效率。

  二、材料与方法

  选取7个欧亚种（瑞都科美、瑞都红玉、巨盛、香妃、早黑宝、玫瑰香、M1）、4个欧美杂种（金手指、巨峰、峰后、Alden）的不同葡萄品种，以及1个杂交后代（R23 X 瑞锋无核）。各葡萄品种采自北京市农林科学院林业果树研究所葡萄资源圃。

  采收新鲜成熟葡萄果实，剥取种子，用湿纱布碾压揉搓，并清水冲洗多次，直到种子周围包被的内果皮除去。把种子置于1L烧杯中，除去上浮的种子，其余种子置于干燥处自然风干后使用。

  种子解剖结构观察：取每个品种完整干种子进行纵切，并且观察种子中的胚的位置，于体视显微镜下拍照记录。

  种皮透水性测试：用亚甲基蓝测试种皮是否具有渗透性，从而阐明种皮透性是否是限制种子萌发的因素。将带有外种皮的完整种子、去除外种皮的完整种子、带有外种皮的剪喙种子和去除外种皮的剪喙种子分别浸入1%亚甲基蓝溶液和无菌蒸馏水（作为对照）中9天。9 天后清洗、干燥，纵向切开种子，并用体视显微镜观察染色情况。

  冷层级+GA3处理：完整种子冷层积3个月后，用4000mg/LGA3分别浸泡12h、24h、48h和72h，在 铺有湿润滤纸的玻璃皿上培养，观察并统计种子的萌发数量。

  种子剪喙—离体胚萌发：将未层积的种子置于离心管中，加入75%乙醇溶液，使用涡旋仪消毒种子1 min，再用无菌水消毒3次，每次1min，2% NaClO溶液（加入200μL吐温）消毒10min后无菌水清洗5次，每次5min，然后在超净工作台内重复上述步骤进行第二遍种子消毒。将消毒后的种子放在带有滤纸的玻璃皿里阴干，然后在无菌条件下用指甲刀去除种子的喙，剪去种子的喙和胚上方的胚乳，置于加入了20g/L蔗糖、7g/L琼脂、1g/L活性炭和0.2mg/L6-BA的MS培养基上，pH调节至5.8。培养24h后，胚从剪喙处流出。将流出的胚置于新的种子萌发培养基上，放置在人工气候箱中26±2℃，光照3000 lx恒温光照培养。培养至胚萌发，即子叶变绿、展开，观察并统计胚萌发的数量，将萌发的胚移入玻璃瓶的生根培养基中（WPM，蔗糖20g/L，琼脂7g/L，活性炭1g/L，IBA0.2mg/L），在组培室光照培养。培养约25-30天，幼苗生长旺盛，把葡萄苗移栽到小花盆中炼苗（图1）。统计剪喙种子的出胚率和萌发率，种子的萌发标准是胚变绿，子叶展开。出胚率（%）：（出胚数/种子数）×100；萌发率（%）：（萌发胚数/出胚数）×100 。

  未出胚种子的纵切结构观察：。为了判断种子未出胚是否由剪喙方法的误差所导致，本试验选取75粒未出胚种子，纵切后在体式镜下观察，观察种子内是否有胚，分别统计种子内有胚和无胚的数量。

  畸形苗的转化：将种子产生的畸形苗移入两种畸形苗转化培养基进行转化试验，培养基配方分别是2MS（两倍浓度的MS）+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1g/L活性炭+0.4mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+10μmol/LZnSO4和 WPM+20g/L 蔗糖+7g/L琼脂+1.5g/L 活性炭+0.2mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA，统计畸形苗转化成正常幼苗的数量，计算畸形苗转化率。

  三、结果与讨论

  3.1 种子结构和形态特征

  12 个葡萄品种成熟种子的外观形态如图2。不同品种种子形态相似，所有品种种子均有喙，但种子大小存在明显差异，‘峰后’、‘金手指’、‘巨峰’等品种的种子从外形来看也大于其他品种。对不同葡萄品种种子的纵切面观察可以看出，胚的空间位置并没有因品种差异而产生明显的变化，均靠近种子喙的位置（图3）。胚被喙附近的种皮和部分胚乳包裹，剪喙后可以移除其机械障碍，使胚直接暴露出来（图4）。

  3.2 种皮透水性分析

  对不同处理葡萄种皮透水性的分析结果显示，去除外种皮的完整种子在清水中浸泡9天，胚和胚乳完全呈现白色（图5 A和B）。带有外种皮的完整种子在清水中浸泡9天, 胚和胚乳也完全呈现白色（图5 C和D）。去除外种皮的完整种子在1%亚甲基蓝中浸泡9天，胚和胚乳并没有呈现蓝色（图5 E和F）。带有外种皮的完整种子在1%亚甲基蓝中浸泡9天，胚和胚乳未染色（图5 G和H）。去除外种皮+剪喙处理的种子在清水中浸泡9天，胚和胚乳完全呈现白色（图5 I和J）。带有外种皮+剪喙处理的种子在清水中浸泡9天，胚和胚乳也完全呈现白色（图5 K和L）。去除外种皮+剪喙处理的种子在1%亚甲基蓝中浸泡9天，胚和胚乳完全呈现蓝色（图5 M和N）。带有外种皮+剪喙处理的种子在1%亚甲基蓝中浸泡9天，部分胚和胚乳呈现蓝色（图5 O和P）。说明葡萄种子的种皮和喙极大的阻碍了水分的吸收。当喙被移除时，这种抑制作用被明显解除。

  3.3 解除种子休眠方法的比较

  用两种不同的处理方法释放成熟葡萄种子中的休眠。第一种处理方法是去除未经冷层积的种子的喙（图6，A-E），而第二种处理方法是先冷层积种子，然后浸泡GA3（图6，F-J）。结果表明，去除喙的处理方法导致无需冷层积的成熟种子在33-38天内萌发成苗。相比之下，涉及冷层积 + GA3浸泡的处理方法将种子萌发成苗的时间延长到123-131天（需要3个月的冷层积加上GA3浸泡后的33-41天）。因此，去除喙的处理方法在显著减少种子萌发所需时间方面非常有效，从而提高了育种计划的整体效率。

  两种方法的发芽率显示出明显差异。剪喙处理的累积发芽率达到了88.3%。相比之下，经过冷层积后，分别浸泡在GA3溶液中12、24、48和72小时的种子的累积发芽率分别为5.1%、6.6%、11.5%和12.3%，与剪喙处理相比明显较低。经过剪喙处理的种子在第4至第7天之间发芽，而经过层积+GA3处理的种子在GA3处理后的第14至第23天之间开始发芽（图7）。这些结果突显了与GA3处理相比，剪喙处理在促进更早、更整齐的种子发芽。

  3.4 未出胚种子的纵切结构观察

  在剪喙—离体胚萌发方法中，发现部分剪喙种子并未出胚，于是我们对未出胚的种子纵切观察，发现仅有2.7%的未出胚种子内部有胚，97.3%的种子的胚都可以从剪喙处流出（图8），说明种子不出胚的主要原因是种子内部没有胚，剪喙方法的人工误差造成种子不出胚的可能性较小。

  3.5 畸形苗的转化

  在种子萌发成苗的过程中，由于胚在处理时受损或生长条件不合适以及种子基因型的影响，通常会产生畸形幼苗。这些畸形苗，大体可将其归为5类（如图9）。将畸形苗转入两种畸形苗转化培养基，在培养基1上进行转化，畸形苗转化为正常幼苗的转化率为10.7%；在培养基2上将畸形苗转入，转化率为15.8%。

  4. 结论

  在这项研究中，具有完整种皮的葡萄种子在没有冷层积的情况下表现出很低的发芽率。本文提出的从种子中分离胚的创新方法被证明是一种成功的替代方法，可以实现发芽而无需冷层积。这种方法有助于快速和整齐的获得葡萄苗，从而加快了葡萄育种。我们的研究结果表明葡萄种子离体胚萌发的最佳培养基配方为MS+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+3g/L活性炭+0.2mg/L6-BA+0.1g/L 肌醇。