贺兰山东麓综合试验站

沈甜 牛锐敏 许泽华 黄小晶 陈卫平 徐美隆

 

  摘  要：为探明UV-B照射时长对赤霞珠酿酒葡萄果实品质及类黄酮物质的影响，试验设立UV-B每天分别照射2、4、6、8 h共4个梯度，以不进行UV-B照射为对照（CK），对不同UV-B照射时长葡萄果实品质及类黄酮物质进行检测分析，为后期应对紫外辐射增强而进行的酿酒葡萄品质调控提供理论依据。结果表明，短时间的UV-B照射会增加果实中可溶性糖含量，UV-B不同照射时长处理的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇和总花色苷含量均增加；UV-B不同照射时长对酿酒葡萄果皮中的类黄酮代谢产物影响显著，筛选出差异代谢物13个，其中5种物质显著上调、8种物质显著下调；在类黄酮和次生代谢产物合成通路上分别富集了7个差异代谢物，占代谢物总数的77.78%。利用主成分对果实品质和果皮类黄酮产物测定值进行综合评价，得分从高到低依次为UV-B照射2 h＞UV-B照射8 h＞UV-B照射4 h＞UV-B照射6 h＞CK。结论：UV-B照射酿酒葡萄‘赤霞珠’2 h时，果实品质和类黄酮代谢产物表现最佳。

  关键词：UV-B，酿酒葡萄，果实品质，类黄酮，代谢产物

  全球气候变暖已成为大趋势，亚洲中高纬地带变暖最为显著，高温强光等极端天气在贺兰山东麓产区生长季节频繁出现，对葡萄生产造成了逆境伤害。应对气候变化，植物体通过一系列的酶促反应和基因表达来调节植物的生理功能，从而改变了代谢产物。研究表明，高温、强光照对果实造成氧化胁迫，影响结构基因的表达量，诱导果实中的过氧化物酶含量上升，减少果皮中花青素含量。Reshef等通过微气象和代谢组学的综合研究，揭示了葡萄黄酮醇-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚对太阳辐射呈对数响应，黄烷-3-醇代谢物对太阳辐射的反应呈阴性，而黄酮醇则呈高度诱导，花色素的整体水平随着日照的增加而降低。

  酚类物质由苯丙氨酸途径(phenylpropanoid pathway)和类黄酮生物合成途径(flavonoid biosynthetic pathway)产生，是植物体内重要次生代谢产物之一，广泛参与植物种子传播、紫外线辐射保护、抵御病原菌等生物过程。在过去几十年中，由于臭氧层衰减直接导致地表UV-B (ultraviolet B，中波紫外线)辐射增强。UV-B能量高，植物响应UV-B辐射伤害的有效途径之一就是合成类黄酮等酚类化合物。UV-B辐射能够增加抗氧化剂的含量和抗氧化酶的活性，增强UV-B辐射可以诱导类黄酮途径中基因的表达和吸收紫外线的类黄酮物质的积累。在UV-B诱导下，蓝莓(Vaccinium spp.)、葡萄(Vitis vinifera)等植物中苯丙氨酸解氨酶（苯丙氨酸代谢阶段起始酶）活性提高。UV-B辐射通过诱导调控MYB、bHLH、WD40基因表达来调节结构基因，进而影响酚类代谢途径和各种酚类物质含量。

  虽然有研究指出类黄酮合成基因受UV-B辐射诱导，但是UV-B照射不同时间下酿酒葡萄类黄酮代谢产物的含量变化尚未清楚。本试验设立不同时间段照射UV-B，采用代谢组学解析不同UV-B照射时长对酿酒葡萄果皮类黄酮代谢物质的影响。研究结果将有助于揭示不同时长的UV-B照射下的酿酒葡萄类黄酮的代谢差异，为后期果实品质调控提供一定的理论支持。

  1 材料与方法

  1.1 试验区概况

  试验区位于银川市西夏区芦花台宁夏农科院现代农业综合试验基地酿酒葡萄资源圃内，东经106°8'42''―106°8'45''，北纬38°38'48''―38°38'57''。试验园地四周空旷、地形平坦，地下水位较浅，土壤属于灌淤潮土，表层沙壤，土壤肥力较高，pH8.1~8.3。年平均气温9℃，降雨量200 mm左右，年蒸发量1400 mm以上，日照时数3000 h以上。采用直立龙干形整形，南北行向定植，株行距0.8 m×3.0 m，冬剪以短梢修剪为主。

  1.2 试验设计及采样

  试验设立5个处理，果实膨大末期（7月29日）开始处理，果实成熟期（9月29日）结束，参考前人研究结果做出调整设计调整，T1：UV-B照射2 h/d，照射时间于8:00-9:00，17:00-18:00；T2：UV-B照射4 h/d，照射时间于8:00-10:00，16:00-18:00；T3：UV-B照射6 h/d，照射时间于8:00-11:00，15:00-18:00；T4：UV-B照射8 h/d，照射时间于8:00-12:00，14:00-18:00；CK：不进行UV-B照射。UV-B强度100 um，照射距离主干1 m。其他栽培管理措施一致。在处理开始后10 d采集果穗直至果实成熟采收，平均每隔15 d取样一次，共采集4次。将果穗放入冰盒带回实验室，用液氮速冻后将果粒用粉碎机粉碎后放入-80℃冰箱保存测定果实基本品质指标，在果实转色期采集整个果穗后，随机取下果粒剥皮用液氮速冻带回实验室测定类黄酮代谢物质，基于类黄酮主要在果皮中合成，所以测定了果皮中的类黄酮代谢产物，果实品质指标则是综合测定整个果粒。

  1.3 试剂与仪器

  无水乙醇、甲醇、无水碳酸钠、氢氧化钠(粒)、氯化钾、三水合乙酸钠、亚硝酸钠、磷酸、磷钼酸，厂家：天津市大茂化学试剂厂；浓硫酸、浓盐酸，厂家：成都市科隆化学品有限公司；蒽酮，上海广诺化学科技有限公司；福林酚，厂家：上海瑞永生物科技有限公司，冰醋酸，厂家：天津市北联精细化学品开发有限公司；儿茶素，厂家：上海源叶生物科技有限公司；对二甲氨基肉桂醛，厂家：上海麦克林生化科技有限公司；六水三氯化铝，厂家：天津市致远化学试剂有限公司；钨酸钠，厂家：天津市凯通化学试剂有限公司，以上试剂均为国产分析纯。甲醇、乙腈，厂家：Merck公司；甲酸，厂家：Sigma-Aldrich公司，均为色谱纯；标准品大于98%，MCE(70%甲醇配置，10 mmol/L)。

  RRH-100型高速多功能粉碎机  上海缘沃工贸有限公司；ME204分析天平  梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；KQ-500DE超声波清洗机  昆山市超声仪器有限公司；KQ5200E型超声清洗仪  昆山舒美；MIX-200型多管涡旋振荡器  上海净信；MM400型球磨仪  Retsch；AS 60/220.R2型电子天平  RADWAG；5424R型离心机  Eppendorf；QTRAP 6500+型三重串联液质联用仪  SCIEX；UV2600紫外分光光度计  上海天美科学仪器有限公司；1580R高速冷冻台式离心机  基因（美国）有限公司。

  1.4 指标测定与方法

  1.4.1 可溶性总糖测定

  参照《葡萄与葡萄酒实验技术操作规范》测定果实可溶性总糖，结果以葡萄糖计。

  1.4.2 可滴定酸测定

  参照《葡萄与葡萄酒实验技术操作规范》测定果实可滴定酸，结果以酒石酸计。

  1.4.3 酚类物质测定

  采用福林-肖卡法测定果实总酚，结果以没食子酸计；采用福林-丹尼斯法测定果实单宁，结果以单宁酸计；pH示差法测定果实花色苷，结果以矢车菊素-3-葡萄糖苷计；总类黄酮采用PEINADO等方法测定，结果以芦丁计；采用p-DMACA-盐酸法测定葡萄浆果总黄烷-3-醇，结果以儿茶素计

  1.4.4 类黄酮代谢物质测定

  液相条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（1.8 µm， 100 mm×2.1 mm i.d.）；流动相：A相为超纯水（加入0.05%的甲酸），B相为乙腈（加入0.05%的甲酸）；流速0.35 mL/min；柱温40℃；进样量2 μL；洗脱梯度：0 min A/B为90:10（V/V），1 min A/B为80:20（V/V），9 min为30:70（V/V），12.5 min A/B为5:95（V/V），13.5 min为5:95（V/V），13.6 min为90:10（V/V），15 min为90:10（V/V）。

  质谱条件：电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度550 ℃，正离子模式下质谱电压5500 V，负离子模式下质谱电压-4500 V，气帘气（Curtain Gas，CUR）35 psi。在Q-Trap 6500+中，每个离子对根据优化的去簇电压（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）进行扫描检测。

  1.5 数据分析

  利用Excel 2007软件进行数据处理与作图，使用SPSS 23.0软件进行显著性和主成分分析，R语言工具绘制主成分分析图。

  2 结果与分析

  2.1 不同处理对果实可溶性总糖的影响

  不同时长的紫外光处理果实可溶性总糖含量变化如图1所示。由图1可知，UV-B照射对果实中的可溶性总糖的积累没有显著性影响，在果实成熟期，UV-B照射2 h处理的可溶性总糖含量最高，成熟采收时比CK高了1.86%。在果实成熟末期，短时间的UV-B照射会增加果实中可溶性糖含量，当UV-B照射超过4h后，果实中的可溶性总糖含量开始下降。

 

  2.2 不同处理对果实可滴定酸的影响

  在开始处理后25天开始监测不同处理果实可滴定酸含量变化，结果如图2所示。由图2可知，除成熟末期，随着UV-B照射时长的增加，其他阶段均是UV-B照射4 h和6 h果实中的可滴定酸含量显著高于其他处理。在开始处理后25、40、55、60 d时，UV-B照射6 h分别比CK组高13.52%、5.74%、14.11%、0.31%。

  2.3 不同处理对果实酚类物质的影响

  图3为不同UV-B时长照射处理果实中的酚类物质含量随果实发育的含量测定值。由图3可知，除UV-B照射开始后的25天，随着果实成熟，UV-B不同照射时长处理的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇和总花色苷含量均增加，但在UV-B开始处理后的25 d时，4 h处理的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇均是最高，比对照分别高5.97%、5.47%、17.14%、26.76%。在成熟采收时，以2 h处理的果实中的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇和总花色苷含量最高，分别比对照增加了17.08%、10.90、25.68%、39.58%、7.93%。UV-B照射4 h果实中的单宁含量随着果实成熟逐渐降低，而其他处理则是在果实成熟末期开始积累。

  2.4 不同处理对果皮黄酮代谢的影响

  2.4.1 不同处理果皮黄酮代谢产物的差异性分析

  为了更加清楚的了解不同UV-B照射时长中类黄酮代谢产物的差异，通过UPLC-MS平台广泛在葡萄转色完成后测定了不同处理果皮的类黄酮代谢产物，结果如表1所示。由表1可知，共检测出62种类黄酮化合物，其中包括17种黄酮醇、14种黄酮、7种黄烷醇、6种查尔酮、6种黄烷酮、5种二氢黄酮醇、3种异黄酮、1种原花青素、1种酚酸、1种口山酮、1个花黄素。

  不同处理的黄烷酮类的橙皮素仅在2h紫外线照射中检测出，含量为0.002 nmol/g，证明短时间的UV-B照射可诱导其积累。不同处理果皮中的黄酮类中的川陈皮素、羟基芜花素、柑橘黄酮3种化合物存在显著差异，其中川陈皮素仅在对照和UV-B照射8h中检测到，且T4处理果皮中的川陈皮素比CK高16.55%；羟基芜花素在T1和T2中未检出，但T3和T4处理中的分别比CK高130%、244%；柑橘黄酮随着UV-B照射时长的增加，逐渐被抑制，在T2、T3、T4处理中未检出，T1处理比CK低了83.72%。黄烷醇类中的银锻苷随着短时间的UV-B照射抑制其合成，但随着UV-B长时间照射其合成受阻，含量降低，T3和T4处理分别比CK降低了19.91%、21.66%。

  UV-B不同照射时长显著影响了葡萄果皮中的类黄酮代谢产物，随着照射时长的增加，显著上调的物质有没食子酸儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表焙儿茶素、儿茶素，显著下调的物质有柚皮素查尔酮、阿福豆素、二氢杨梅素、异鼠李素、黄酮醇类中的白麻苷、芦丁、金丝桃苷、阿福豆苷。先下调后显著增加的物质是杨梅素，其T2处理的含量最低，比CK降低了23.65 nmol/g，8h紫外线照射处理的含量最高，比对照增加了33.5 nmol/g。先显著降低后增加的物质是槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷在2h紫外线照射的最低，比对照降低了231.47 nmol/g，8h紫外线照射的含量最高，比对照增加了22.19 nmol/g。

 

  2.4.2 不同处理果皮类黄酮代谢产物的热图分析

    

  不同处理果皮类黄酮代谢产物热图分析结果如图5所示。由图5可知，不同处理中类黄酮代谢物不同处理的差异大于组内差异，其中：UV-B照射8h的黄酮醇类代谢物含量平均最高，UV-B照射2 h和4 h处理的平均低于CK；在黄烷醇、异黄酮、原花色素、酚酸和山口酮及部分二氢黄酮醇中，随着UV-B照射时间的增长代谢物平均含量是先降低再增加，以UV-B照射8 h的平均含量最高，2 h的最低；在黄酮类中，短时间的UV-B照射增加了其代谢含量，随着照射时间的增加其代谢物平均含量逐渐降低，但在8 h时黄酮类代谢物显著增加，且平均含量高于CK；随着UV-B照射时间的增加，黄烷醇类代谢物平均含量呈先增加后降低的趋势，UV-B照射6 h平均含量最高。

  2.4.3 不同处理差异代谢物KEGG分类

  将所有处理的差异代谢物匹配KEGG的数据库以获得代谢物参与的通路信息，对注释完的结果进行富集分析，获得差异代谢物富集较多的通路。由图6可知，所有处理的差异代谢物主要注释和富集在异黄酮合成通路、黄酮和黄酮醇合成通路及的合成通路。在类黄酮和次生代谢产物合成通路上均富集了7个差异代谢物，占代谢物总数的77.78%。

 

  2.5 果实品质综合分析

  基于全部测定指标进行降维因子分析，共提取4个主成分，贡献率分别是42.714%、25.335%、17.057%、14.894%，累积贡献率为100%，即这4个主成分已经代表了处理的品质特性指标的全部信息，因此选择提取4个主成分适宜。根据各指标因子的成分矩阵和PC初始特征值，确定PC对应不同因子的权重，建立得分模型，再结合PC贡献率最终得到不同UV-B时长照射处理下果实品质的综合得分（表2）。

 

 

  由表2可知，不同UV-B照射时长处理的‘赤霞珠’果实综合品质表现为T1（UV-B照射2 h）＞T4（UV-B照射8 h）＞T2（UV-B照射4 h）＞T3（UV-B照射6 h）＞CK（未做处理）。结果表明，短时间的UV-B照射激发果实酚类物质的合成，随着UV-B照射时间的增加，对酿酒葡萄发育造成了胁迫，有利于促进果实成熟及次生代谢物的合成和积累。

  3 讨论与结论

  全球气候变暖导致世界优质酿酒葡萄栽培区发生空间位移，可能导致高纬度区域变为更适宜葡萄生长和葡萄酒生产，并对酒种和品种布局也产生较大影响。UV-B辐射同其他胁迫一样可以刺激植物对环境改变做出响应，从而激发一系列对自身有益的调节反馈机制，使植物在一定条件下逐渐适应胁迫环境。在葡萄中，黄酮类物质的含量通常被作为植株对UV-B辐射耐受性的衡量标准。研究指出，长时间、高强度UV-B辐射致使叶绿体结构被破坏，以致光合速率下降，光合产物积累减少，还原糖含量降低，从而合成酚类前体物质减少，最后直接影响植物酚类化合物的积累。本试验中，在果实成熟末期，短时间的UV-B照射会增加果实中可溶性糖含量，当UV-B每天照射超过4h后，果实中的可溶性总糖含量开始下降。在本研究中，除UV-B照射开始处理后的25天，均是随着果实成熟，UV-B不同照射时长处理的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇和总花色苷含量均增加，在成熟采收时，以2h果实中的总酚、单宁、总类黄酮、黄烷-3-醇和总花色苷含量最高，分别比对照增加了17.08%、10.90、25.68%、39.58%、7.93%，印证了上述前人研究结果。

  近几年研究发现UV-B辐射增强对类黄酮化合物合成有显著影响，UV-B辐射的持续时间直接影响了植物的生理反应程度。类黄酮在UV-B条件下的积累与苯丙素的生物合成途径有关，植物通过增加PAL活性，诱导类黄酮等紫外吸收物质合成，以抵御UV-B辐射对植物的伤害。植物对UV-B的响应程度取决于其胁迫强度，本研究中，UV-B不同照射时长显著影响了葡萄果皮中的类黄酮代谢产物，随着UV-B照射时长的增加，显著上调的物质有没食子酸儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表焙儿茶素、儿茶素，显著下调的物质有柚皮素查尔酮、阿福豆素、二氢杨梅素、异鼠李素、黄酮醇类中的白麻苷、芦丁、金丝桃苷、阿福豆苷。本试验结果得出，在类黄酮和次生代谢产物合成通路上均富集了7个差异代谢物，占代谢物总数的77.78%。UV-B照射酿酒葡萄‘赤霞珠’2 h时，果实综合品质表现最佳。研究指出，UV-B辐射增强对酚类合成作用表现为低强度促进高强度抑制，本试验研究结果是每天进行短时间UV-B照射显著提高果实品质，促进类黄酮积累，果实综合品质随着UV-B照射时间的增加表现出先降低后提高。

  类黄酮合成基因受UV-B辐射诱导，在植物细胞壁、液泡、叶绿体、腺体等一些特殊部位积累。UV-B通过U-VR8光感受器，介导UV-B诱导的光形态建成，介导一系列重要的UV防御基因的表达。在高通量下，UV-B辐射产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)氧化脂质和蛋白质，对生物膜、DNA造成损伤。本试验中，仅研究了果皮类黄酮类代谢物质对不同UV-B照射时长的响应结果，未从调控基因表达上解析其影响机制，今后将在贺兰山东麓产区继续开展增加UV-B照射对类黄酮相关基因合成表达的研究，以探究促进葡萄抵抗非生物胁迫的次级代谢物质的合成机制，为应对紫外辐射增强引起的酿酒葡萄品质变化有一定的理论支撑。