胶东综合试验站

唐美玲团队

  近些年，农业生产追求快速高效的经济效益，过量使用化肥，导致了土壤板结酸化等一系列问题，研究表明，土壤微生物在固氮、解磷等方面具有一定作用。有研究表明施用有机肥提高了根际土微生物群落的多样性和丰富度，增加了果园植株根际土壤的酶活性，提高了土壤微生物对碳源的利用率，使微生物保持较高的活性（胡可等，2010；杨文娜等，2022）； 不同有机肥与化肥以1:1的配施可以提高土壤生物多样性，改变土壤的细菌群落结构，有机肥和猪粪有机肥处理的细菌结构相似，而单施化肥与不施肥处理的细菌结构相似（罗佳等，2016）；增施有机肥可以丰富土壤线虫食物网结构，提高土壤环境的稳定性，为土壤线虫类群多样性提供基础（张婷等，2020）；探究不同有机无机肥配施与单施化肥相比对土壤微生物功能多样性的影响，结果试验表明生物炭配施有机肥提高了微生物的代谢活性，微生物对酚酸类、碳水化合物碳源的利用率提升，这种处理还增加了放线菌数量，降低了真菌数量（许跃奇等，2020）。本研究通过对威海地区阳光玫瑰葡萄的肥料管理，采用不同比例有机肥与无机肥的配施处理，探究其对阳光玫瑰葡萄果实品质、树体长势、果园的土壤性状的影响，为得到阳光玫瑰优质栽培的最适宜肥料配施比例提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 试验区概括及供试材料

  试验地点在山东省威海市南海新区七彩万和农业公司的葡萄种植园区进行，园区建有300亩葡萄生产园，试验区属北温带季风型大陆性气候，四季变化和季风进退较为明显，产区年平均气温11.9℃ ，年平均降水量 730.2 mm，年平均日照时数2538.2 h。试材为3年生阳光玫瑰葡萄，砧木为5BB，株行距为9.0 m×9.0 m，树形为H型，栽培模式为避雨栽培，土壤管理方式为行间自然生草。

  1.2 验设计

  试验设置4个不同施肥处理，分别为：T1：单施化肥、T2：25%N由有机肥替代、T3：50%N由有机肥替代、T4:75%N由有机肥替代；每个处理三次重复小区，每小区面积80 m2，小区田间完全随机分布；利用无机化肥调节各处理氮、磷、钾养分用量相同，分别为：N：35.6 kg、P2O5：21.6 kg、K2O：48.0 kg；其中有机肥在春季一次性施入，无机肥料根据葡萄生长的萌芽期、幼果期、硬核期、转色期四个周期的需肥量分批施入，施用肥料的养分含量如下：有机肥（N：1.78%、P2O5：0.156%、K2O：2.92%；有机质：45%，购自烟台鸿牧农业科技有限公司）、复合肥（N：15%，P2O5：15%，K2O：15%）、磷酸二氢钾（P2O5：52%、K2O：34%)、尿素（N：46.4%、）、四水合硝酸钙（含N：11.86%、CaO：23.73%）、磷酸二氢钠(P2O5：59.17%)、硫酸钾（K2O：54.02%）；具体施肥方法为：在以植株为圆心半径1米挖宽度和深度均为40 cm的环状沟；不同处理养分用量如表1。

  1.3 土壤样品采集

  采集距离树干30cm处，深度0-30cm的根系，用毛刷采集根际周围的根际土，放置于无菌离心管中，样管做好标记，将土壤装入后置于液氮中速冻后放入-80°C保存，以备土壤微生物测定用。

  1.4 测定方法

  土壤微生物测定

  用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA，U.S.) 试剂盒提取土壤总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。土壤细菌扩增引物为341F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)，土壤真菌扩增引物为ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物经电泳检测，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收，回收产物由上海凌恩生物科技有限公司基于Illumina PE250平台高通量测序。测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，用Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析（置信度阈值为0.7），比对数据库为Silva（细菌）和Unite（真菌），统计各样本的群落组成。

  1.5 数据处理与分析

  使用IBM SPSS 20.0对试验数据进行分析处理， Excel 2010和Graphpad 8.0绘制图表。

  2 结果与分析

  2.1 有机无机肥配施对葡萄园土壤微生物数量的影响

  土壤微生物在繁殖生长过程中消耗土壤有机质的同时也加速了有机质的分解利用，提高土壤肥力，稳固了植物根系生长土壤环境。由图可知，微生物OTU数目随着有机肥施用量的增加而增加。T1、T2、T3、T4处理土壤微生物的特有OTU分别为194、432、303、515个，这表示添加有机肥的土壤中微生物的OTU数目增多。T1和T2有相同OTU序列的数目为94个，T1和T3相同的OTU为94个，T1和T4为211个；T2和T3有117个，T2和T4有404个，T3和T4有85个，说明T2处理与T4处理的微生物分布相似性最高。

  2.2 有机无机肥配施对葡萄园土壤微生物多样性的影响

  通过单样品的多样性分析（α多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，反映物种丰富度的指数有，Shnano指数、Simpson指数，体现物种分布丰度的指数有Chao 指数，Chao指数的排序是：T4＞T2＞T1＞T3，这三个指数的T3处理都显著低于其他三个处理，Chao值越高代表物种丰度越高；而Simpson指数值越大，说明群落多样性越低，Shannon值越大，说明群落多样性越高，Shannon 指数为：T4＞T2＞T1＞T3，说明T4处理和T2处理的生物多样性高于全施化肥处理。而coverage指数是反应测序完整度的指数，指数值越接近1，则测序的样品物种覆盖度就越高。

  由表不同施肥处理对葡萄果园土壤微生物多样性的影响结果可知，在OTU相似水平为97%时，微生物Chao 指数和 Shannon 指数有所差异。结果表明25%有机肥配施和50%有机肥配施的生物多样性明显高于全化肥施用。

  2.3 有机无机肥配施对葡萄园土壤微生物群落组成的影响

  土壤细菌和真菌的群落组成如图4所示，可知在门级处理下中酸杆菌门（Acidobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）等9个已知优势菌门（相对丰度高于1%的菌门）。T1、T2、T3处理按丰度数据排行前八的优势菌门为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、髌骨细菌门、Gemmatimonadota、厚壁菌门；T4处理中按丰度排序为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、Gemmatimonadota、拟杆菌门、髌骨细菌门、疣微菌门；在T4处理中厚壁菌门不属于优势菌门，而疣微菌门丰度大于1%且在八个优势菌门中丰度最低。在共同的优势菌门中，T4处理中的放线菌门、绿弯菌门、Gemmatimonadota、髌骨细菌门显著高于T1处理丰度。50%有机肥配施和75%有机肥配施中的菌门丰度大于全施化肥的优势菌门丰度。

  在属的分类水平上，各处理的土壤细菌和真菌按照丰度排序如图所示。土壤中朱氏杆菌属（Chujaibacter）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、Vibrionimonas、Saccharimonadales、慢生根瘤菌属、酸热菌属较为丰富。各处理的优势菌属分布相似，其中最大优势属为朱氏杆菌属，范围是9.18%~25.59%，T3处理该菌属丰度最大。50%有机肥配施中优势菌属数多于75%有机肥配施，有机肥施用量增加与全施化肥处理的菌属丰富度有较大差异。

  2.4 葡萄园土壤微生物主成分分析

  根据Operational Taxonomic Units（OTUs）对主成分的贡献程度作出的主成分分析如图6所示，T1处理、T2处理和T4处理距离较近，说明这3个处理的土壤微生物结构主成分相似。T3处理与T1处理、T2处理和T4处理的样本点的距离较大，说明T3处理与其他处理间的微生物结构主成分存在差异。说明施用有机肥以及施用不同量的有机肥对土壤微生物会产生不同的影响。PC1轴和PC2轴对样品组成差异的贡献值分别为47.01%和16.45%。

  3 小结

  不同比例有机肥的施用都能提高土壤有机质含量、土壤矿质元素的含量和土壤酶活性，且能丰富土壤微生物多样性，以75%有机肥与无机肥配施处理效果最好。