树体病害防控岗位

  多年生葡萄在其生长周期中会面临多种生物和非生物因素的挑战。例如，盐分胁迫和干旱等非生物因素，新的病原菌出现，以及感病品种、农药的过度使用，均可导致葡萄产量和质量的下降，给葡萄产业带来巨大经济损失，对葡萄的可持续性生产构成重要威胁。

  由于童期较长、远缘杂交不亲和性、基因杂合度较高及表型鉴定筛选时间长等因素，传统杂交育种耗时长且难度大。随着生物信息学、功能基因组学和分子生物学的迅速发展，转基因技术将人工分离、修饰过的优良性状的基因，利用生物、物理或化学等方法导入某一品种中，筛选优良品系，该技术为植物育种提供了有价值的工具。转基因技术也存在诸多局限性：外源片段随机整合到基因组中、多数葡萄品种难以转化并且耗时较长以及公众对转基因安全的担忧。不依赖外源基因片段的导入，以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术受到科研人员的高度关注，该技术能够定向修改靶标基因的结构和功能，如靶向突变、修饰、插入、替换等。

  1 CRISPR/Cas系统的作用机制

  根据效应蛋白类别、基因组作用位置、pre-crRNA加工和干扰方式的不同，可将CRISPR-Cas系统分为两大类和几个亚型。一类CRISPR/Cas系统中RNA引导的靶位点切割需要多种效应蛋白的参与，包括I型、III型和IV型。二类CRISPR/Cas系统中DNA序列的编辑仅需要一个RNA引导的内切酶的参与，包括II型，V型和VI型。Cas3标记基因编码一个含有解旋酶的免疫蛋白，可解开DNA-DNA和RNA-DNA双链，在I型系统的CRISPR/Cas位点起作用。Cas9蛋白具有多个结构域，靶向双链DNA（dsDNA），在II型基因位点进行编辑。Cas10标记基因存在于III型CRISPR/Cas中，含有一个palm结构域，可以靶向单链DNA（ssDNA）进行编辑。其它Cas蛋白，csf1(大亚基，Cas8类似)标记蛋白属于IV型位点；RuvC基因，由普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1 (Cpf1)、C2c1或C2c3蛋白的CRISPR编码，携带Cas12标记基因(一种DNA修复相关的大肠杆菌蛋白)结构域，属于V型位点，可切割dsDNA或ssDNA。VI型含有一个名为Cas13 (C2c2)的核苷酸结合结构域(HEPN)，在高等真核生物和原核生物中负责切割ssRNA。

  CRISPR-Cas系统的作用模式可分为三个阶段：适应、表达和干扰。在病毒感染之后，细菌会将病毒的DNA片段整合到宿主基因组的CRISPR位点中，在II型CRISPR系统中，这些外来的DNA片段（称为“原间隔序列”）被插入到CRISPR重复序列之间。CRISPR位点的重复序列被转录形成前体crRNA（pre-crRNA），这些前体crRNA经过加工后成为成熟的crRNA。每个crRNA都包含一个与其对应的原间隔序列，这个序列是CRISPR系统识别和靶向外来DNA的关键部分。成熟的crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）配对，形成crRNA:tracrRNA复合体，这个复合体与Cas9核酸酶结合，形成功能性的复合物。Cas9核酸酶只有在crRNA中原间隔序列的解码部分相邻存在PAM（原间隔序列邻近基序）时，才会被引导至反向互补的目标DNA序列，并在该DNA上产生双链断裂。

  2 Cas 蛋白

  Cas1-Cas2核酸外切酶系统普遍存在于所有CRISPR-Cas系统中，它有助于切割靶DNA和CRISPR阵列，这是CRISPR-Cas机制中的一个关键步骤。Cas1和Cas2蛋白在E. coli K12中分离发现，它们形成一个六聚体复合物。Cas1是一个具有中心铁氧还蛋白折叠的不对称同源二聚体，而Cas2则是一个具有中心铁氧还蛋白折叠的对称同源二聚体。该复合物通过X射线衍射的分辨率为2.3 Å。它们都是杂合分子，通过酯交换反应催化间隔序列的整合。最近的研究表明，Cas1-Cas2蛋白能够识别修复复合物中经过重新退火后包含有前间隔序列和PAM序列的DNA片段，并能够灵活地与其它辅助蛋白协调处理前间隔序列和整合的方向性。Cas1-Cas2通过在前间隔序列初步整合到宿主CRISPR阵列后切割PAM来保护宿主CRISPR系统，因此有可能被用作缺乏Cas4的系统的替代品。

  Cas9，之前亦被称作Csn1或Csx12，是与一种源自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR适应性免疫机制相关的重要蛋白。作为首个被应用于基因编辑的Cas蛋白（即SpCas9），其工作机制已在众多生物体内得到了详尽的研究与广泛应用。在天然及人工构建的CRISPR/Cas系统中，SpCas9蛋白扮演着DNA核酸内切酶的角色，其庞大的多功能结构域由1368个氨基酸编码生成。Cas9核酸内切酶包含六个功能域，包括RuvC和HNH两个核酸酶域和一个PAM互作结构域。Cas9蛋白的核心功能是在dsDNA中的PAM序列上游精确切割三个碱基对，进而引发双链断裂。由于CRISPR/Cas9系统将双链tracrRNA和crRNA融合为单链向导RNA（sgRNA），它得以精准地靶向并切割特定的dsDNA或ssDNA序列。通过CRISPR-Cas9系统实现的切割，后续可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径进行修复。HDR过程往往需要模板DNA的参与，这些模板可以是姐妹染色单体或外源提供的，并与DSB同源序列的DNA片段（用于基因敲入）。与ZFN和TALEN等传统基因组编辑工具相比，CRISPR-Cas9以其设计的简便性与高效性脱颖而出，成为首选工具。此外，CRISPR-Cas9系统还具备同时创建并使用多个序列特异性sgRNA的能力，这一特性极大地促进了多重基因编辑的发展，使其成为性状改良领域的重要工具。该系统已被广泛应用于微生物、植物、动物、昆虫及人类细胞系等多个领域的研究中。尽管CRISPR/Cas9系统在多个方面取得了显著进展，但仍面临脱靶突变及PAM序列偏好性等问题的挑战。此外，利用HDR修复途径的CRISPR/Cas系统有时会产生非预期的突变。为解决这些问题，研究人员开发了缺乏核酸内切酶活性的Cas9突变体，如Null-Cas9（dCas9）。Cas9系统可用于表观基因编辑而不引起不可逆的基因组改变。然而，为进一步提升Cas9的特异性并减少脱靶效应，仍需持续的研究与探索。

  在可编程基因组编辑领域内，Cas9和Cas12a蛋白是最为常用的两种。相较于Cas9，Cas12a蛋白能够识别富含“T”的PAM序列，并产生交错的DNA末端，这一特性促进了更为高效的位点特异性整合。鉴于调控元件多富含“AT”序列，Cas12a因此成为实施表观基因组修饰的高效工具。Cas12a系统由蛋白/效应核酸酶复合物和单个crRNA这两个核心元件构成，这一简化的结构使得Cas12a能够自主加工crRNA，而Cas9则依赖于额外的tracrRNA来形成成熟的crRNA。Cas12a家族中的三个同源基因：FnCas12a（源自新弗朗西斯菌）、LbCas12a（源自毛螺旋菌科细菌）和AsCas12a（源自酸杆菌属）拥有相似的结构域，被广泛应用于植物基因组编辑技术中。最近的研究报告中，Cas12a家族新增的两位成员，Ev1Cas12a和Hs1Cas12a，在水稻和番茄原生质体中展现了高效的多重基因组编辑能力。Cas12a编辑技术已成功应用于多种作物，包括水稻、小麦、番茄、柑橘、大豆以及模式植物拟南芥，尽管各作物间编辑效率存在差异。此外，研究人员还发现了CRISPR/Cas12j（又称CasΦ）和Cas12f系统的微型变体，这些变体的尺寸不到Cas9的一半，它们的同源物在植物中已得到了成功测试。当前，科学界正致力于开发Cas12a的改进版本，旨在改变其对PAM序列的特异性，并增强其温度敏感性，以期实现更灵活的应用及更有效的植物系统递送。

  Cas13蛋白至少存在于21种细菌基因组中，它们由两个独特的HEPN结构域和一个效应蛋白组成。CRISPR-Cas13是已知的唯一一种靶向ssRNA的系统，由于这种能力，Cas13在植物中具有强大的应用潜力，可以靶向RNA（编码和非编码）并沉默RNA病毒的防御反应。最近的研究表明，即使在缺乏Cas13蛋白的情况下，Cas13独立引导的基因沉默（GIGS）也能显著降低烟草、番茄和拟南芥中的病毒载量，为研究组织特异性或时间特异性表达提供了潜在的系统，而这些研究在其它CRISPR-Cas系统中难以操作。Cas13a的同源物LwaCas13a（来自沃氏梭菌的Cas13a）和LshCas13a（来自沙氏梭菌的Cas13a）已在植物中进行了成功测试，效率适中。与Cas13a相比，Cas13d亚型是一种较小的蛋白质，已被发现在24-41°C表现均高效。为了高效的将特定效应子靶向特定RNA以进行特定修饰，科研人员研发出修饰和可编程的Cas13突变体形式（dCas13和Cas13x）。由于固有的crRNA生物合成机制，可利用Cas13靶向RNA并进行选择性地编辑。与RNA干扰不同，CRISPR/Cas13诱导的基因组变化不仅限于靶向细胞质的转录本。此外，Cas13选择性地敲除细胞质mRNA转录本，从而实现更快的表达下调。这些发现表明，该系统在多倍体植物中进行多基因沉默方面具有广阔的应用前景。

  CRISPR-Cas框架中的Cas12f蛋白因其独特的生化特性而备受关注。该蛋白源自极端嗜热生物，并且能在无需PAM序列的情况下高效结合ssDNA。CRISPR/Cas12f系统已被用于单核苷酸多态性（SNPs）的检测和基因分型，以提高作物对ssDNA病毒的抗性。与传统的Cas9蛋白相比，Cas12f蛋白具有多个优势。例如，Cas12f的分子量极小，仅包含500个氨基酸，因此比Cas9蛋白更能高效地递送至目标生物体中。此外，基于Cas12f的生物传感器（如HARRY）在检测多种目标物时表现出更高的灵敏度，因此相较于Cas12和Cas13蛋白等其它类型，它们获得了更多的关注。

  3 CRISPR/Cas在育种中的应用

  CRISPR-Cas9基因编辑技术能够修改几乎所有植物种类中的任意基因。凭借其易用性、高效性、成本效益以及精确靶向多个基因的能力，相比其它方法，它加速了基因改良的进程。即便是以往被忽视的植物种类，现在也能通过此技术进行遗传改造，为作物育种和可持续农业的发展开辟了广阔前景。CRISPR-Cas9已经创造了诸多令人瞩目的遗传改良成果，旨在优化代谢途径、增强对生物（如真菌、细菌或病毒病原体）及非生物（如寒冷、干旱或盐碱）胁迫的抵抗力、提升营养成分、增加产量和提高质量、促进单倍体种子生产、赋予除草剂抗性等。

  植物的生长发育是决定其体型、分布密度以及最终生产力的关键因素。为了通过提高种植密度来增加产量，同时提升养分和水分的利用效率，培育矮化果树已经成为一种重要的策略。然而，调控这些矮化果树的株高并非易事，这促使了以植物激素和遗传学为中心的研究工作。植物激素在植物生长和结构中起着关键作用。其中，赤霉素(GAs)被公认为具有刺激植物伸长的能力，参与GAs生物合成的基因被破坏可导致植物矮化。MaGA20ox2基因在Gros Michel香蕉品种中参与赤霉素的生物合成和株高调节，CRISPR/Cas9技术已成功修饰MaGA20ox2基因并产生半矮秆突变体。异常水平的脱落酸(ABA)可以通过影响植物的生长和发育而导致果树侏儒症。Pang等通过基因编辑产生6个矮化的纯合突变梨系，这些突变体表现出内源ABA水平升高和ABA通路基因表达的增加。Sattar等利用CRISPR/Cas9技术，通过修改PbPAT14基因功能，证实了矮梨的遗传改良潜力。

  如今，CRISPR/Cas技术已被用于研究植物对各种环境胁迫的耐受性。脱水反应元件结合（DREB）转录因子（TF）在调控多种应激诱导基因中发挥着关键作用，已有研究表明，DREB2型蛋白作为DREB蛋白的一个亚型，在多种植物（包括果树）中显著提高了对干旱、盐度和高温的耐受性。例如，MsDREB6.2的过表达显著增强了转基因苹果品系的抗旱性，而冷诱导型转录因子AtDREB1b的过表达则增强了转基因葡萄的抗寒性。苹果CDPK基因（称为MdCIPK6L）的过表达显著提高了对盐、渗透、干旱和冷胁迫的抗性，同时没有损害根系的生长。

  据估算，病毒、真菌和细菌等生物因素已导致全球作物产量损失高达20%-40%。CRISPR-Cas系统已被证明是一种强大的工具，可特异性敲除不良基因，并使植物对多种病害产生耐受性。白粉病是作物面临的最具破坏性的真菌病害之一，因为它会显著降低作物产量。在葡萄中，通过CRISPR/Cas9介导的VvMLO基因敲除，实现了对白粉病的抗性。此外，尽管免疫力并未完全恢复，但CRISPR/Cas9介导的SlPMR4突变显著增强了番茄对白粉病的抗性。镰刀菌枯萎病和稻瘟病等其它几种具有破坏性的真菌病害也会造成严重的作物损失，而缺乏抗性种质资源则限制了通过传统育种手段开发抗性品种的可能性。在水稻中，使用CRISPR/Cas9突变OsERF922和OsSEC3A基因，所测试的植株在幼苗期和分蘖期均表现出对稻瘟病的显著抗性。CRISPR/Cas9诱导的番茄感病基因SlDMR6-1突变使其对细菌、卵菌和真菌等多种病害产生抗性。CRISPR/Cas9介导的osnramp1突变体表现出了对细菌和真菌的广谱抗性，这些突变体虽然过氧化氢酶（CAT）活性降低，但过氧化氢（H2O2）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性升高。

  通过修改甲基化模式或沉默果树中参与乙烯生物合成、成熟过程或其信号通路的关键基因，可以实现延长果实保质期的目标。研究人员采用CRISPR/Cas9敲除MaACO1（氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1）基因，该基因负责编码将ACC转化为乙烯的酶。与野生型香蕉相比，这种基因修饰使果实的保质期延长了多达40天。

  红色果实富含抗氧化剂、矿物质、维生素和膳食纤维等多种生物活性成分和营养物质，一直是研究的热点。在此背景下，CRISPR/Cas9技术已展现出其在调控果实特定性状方面的能力。例如，利用该技术编辑MdMKK9基因，导致苹果中花青素表达水平显著提高，从而使苹果呈现出特有的红色。此外，植物还能产生各种次生代谢产物，这些物质在控制生长、成分再生和营养增强方面发挥着重要作用。类胡萝卜素就是其中的一种，它参与光合作用并具有抗氧化功能，为果实和其它植物器官增添了吸引人的色彩。植物八氢番茄红素脱氢酶（PDS）已被确定为类胡萝卜素合成途径中的关键酶。利用CRISPR/Cas9系统消除PDS基因，产生了具有白化表型的突变体，这进一步强调了该基因在类胡萝卜素合成中的重要性。通过使用CRISPR/Cas9技术修改番茄红素ε-环化酶基因，成功提高了香蕉中的β-胡萝卜素含量。对于富含酚类代谢产物的石榴，研究人员使用CRISPR/Cas9删除了两个UDP-糖基转移酶基因PgUGT84A23和PgUGT84A24，导致酚类花青素含量降低。

  4 机遇与挑战

  基于CRISPR的基因编辑技术在许多领域都有应用，如农业增产和植物功能基因组学。由于CRISPR-Cas9技术易于操作，因此获取相对容易且成本较低。在全球超过25个国家中，基因编辑技术已经被应用于40多种作物的改良，以提高粮食和饲料的质量或抗逆性，但到目前为止，只有六种具有不同性状的基因编辑作物被批准商业化。尽管CRISPR-Cas系统具有巨大的应用潜力，但许多国家对于种植这些基因组编辑作物的规定仍不确定。其它主要风险因素包括脱靶突变的发生和可能破坏自然生殖屏障，从而阻止某些突变在自然界中发生。然而，目前正投入大量努力来改进计算和生物信息学工具，以最大限度地减少脱靶编辑，并更好地了解使用CRISPR技术产生的非靶标突变的性质和频率。此外，还必须考虑到，在传统植物育种过程中，每一代都会发生自然突变，而通过化学或辐射产生的突变频率比自然突变频率高出1000倍，当前基因组编辑工具产生的非靶标突变频率也高于自然突变频率。因此，重要的是要评估基于CRISPR的技术与其它传统植物育种方法相比的风险。围绕CRISPR-Cas9技术的监管环境不断变化，各国和各监管机构对其监管的态度各不相同。因此，必须制定明确的规则和法规来规范CRISPR-Cas9的使用，以确保其符合伦理、执行负责，并坚定致力于环境和人类安全。

  利用便捷、精确且用户友好的CRISPR-Cas工具包，植物基因编辑变得轻而易举。CRISPR技术展现出广泛的应用前景，不仅助力提升全球粮食安全，还在合成生物学中引入外源基因，并深入阐明植物基因组的结构与功能。同时，该技术能够作用于多个位点，对驯化及野生植物实施基因编辑，显著提升编辑的特异性和效率。尽管基因驱动技术有望根除杂草和害虫，但在构建稳固、规范的监管框架之前，监管机构与科研人员需携手合作，严防非法基因编辑行为。

  当前，CRISPR/Cas9技术正积极应用于改善包括单子叶与双子叶植物在内的多种性状，如增强非生物胁迫耐受性、提升抗病性、优化品质及提高产量。通过多样化的方法探究单个基因的功能，研究人员能够精准修改作物基因组序列，以实现产量的飞跃。Cas蛋白在基础科学、治疗研究及诊断领域均发挥着关键作用。鉴于CRISPR/Cas系统成本低廉且操作简便，众多科研人员正积极利用这一平台，深入探索不同生物体基因的功能奥秘。此外，揭示Cas基因家族中复杂而迷人的进化历程，这些基因广泛分布于各类微生物及古菌中，将深刻影响新疾病诊断、药物研发、农业改良及育种等多个领域。若这些蛋白质的先进基因编辑潜力得以充分挖掘，或将引发一场前所未有的CRISPR“革命”，推动该技术在不久的将来实现更加广泛而引人注目的应用。