质量安全与营养品质评价岗位

王新全 赵慧宇 齐沛沛 汪志威 狄珊珊

  摘要：蓝莓作为全球公认的五大健康食品之一，挥发性风味物质是决定其品质和消费者接受度的关键因素之一。目前的蓝莓挥发性成分分析方法存在灵敏度低、重现性差等不足。因此，开发一种准确可靠的挥发性成分分析方法十分必要。本研究优化了HS-SPME萃取风味物质的相关实验方法。在蓝莓中共鉴定出318种挥发性成分，主要包括醛类、萜类、醇类、酯类、碳氢化合物、酮类、杂环类、酸类和酚类。2-已烯醛和芳樟醇是主要的挥发物。此外，还鉴定出了39种具有气味活性值（OAV）>1特征的挥发性化合物，其中醛类、萜烯类物质是蓝莓中最重要的风味成分，其次是醇类、酮类、烃类、酚类和杂环化合物。各品种香气组成中“果香”、 “花香”的香气最突出，其次是“绿色”、 “青草香”、“木香”和“脂香”。本研究为蓝莓风味品质的评价提供方法基础。

 

  关键词：顶空-固相微萃取；蓝莓；风味；气相色谱飞行时间质谱

 

  Development and comprehensive HS-SPME-GC/Q-TOF-MS analysis optimization, comparison, and evaluation of different blueberry (Vaccinium spp.) varieties volatile flavor

  QIAO Chen1, ZHAO Hui-Yu1*, Wang Xin-Quan1,*, QI Pei-Pei 1, LIU Zhen-Zhen1, DI Shan-Shan1, WANG Zhi-Wei1,

  (1. State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Hangzhou 310021, China）

  Abstract: Blueberries are recognized globally as one of the top fivehealth foods, with the predominant cultivation varieties being the southern highbush and northern highbush. The sensory attributes of blueberries, characterized by a complex array of volatile organic compounds (VOCs), are pivotal in determining their quality and consumer acceptance. Employing the headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) technique, the extraction of blueberry's volatile flavor constituents was optimized across four critical parameters.A total of 318 volatile components from 23 blueberry cultivars were identified and quantified, covering a variety of chemical classes including aldehydes, terpenes, alcohols, esters, hydrocarbons, ketones, heterocyclic compounds, acids, and phenols. Notably, 2-hexenal and linalool emerged as predominant volatiles, significantly influencing the blueberry's flavor profile. Furthermore, 39 key flavor compounds with odor activity values (OAV)>1were identified, which are instrumental in shaping the distinctive flavor of blueberries. Comparison of aroma profiles based on odor ring charts highlighted the predominance of "fruity" and "floral" notes among the varieties, succeeded by "green,""herbaceous woody," and "fatty" characteristics. Utilizing hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA), and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), the volatile flavor profiles of the 23 blueberry species were discernibly differentiated. This study not only furnishes a robust analytical approach for the classification of blueberry varieties but also lays a foundational framework for the appraisal of blueberry flavor quality and the informed selection and cultivation of novel cultivars.

  Keywords: HS-SPME, blueberry, flavor, GC-Q-TOF

 

  蓝莓（Vaccinium spp.）具有抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、促进视红素再合成、预防心脏疾病等功效。鉴于这些健康益处，联合国粮农组织（FAO）已将蓝莓列为五大健康食品之一，并在全球范围内被誉为“超级水果”。蓝莓的原产地主要位于加拿大和美国北部地区。随着公众对蓝莓的营养和保健功能认识的不断加深，蓝莓的全球市场需求正在迅速增长。目前，蓝莓的种植已经扩展到北美、亚洲、欧洲以及南美等多个地区。蓝莓的香气是由多种挥发性有机化合物（VOCs）共同作用的结果，这些化合物的感知对于蓝莓的品质评价和市场可销售性具有至关重要的影响。因此，对蓝莓挥发性风味成分的深入研究不仅能够揭示品种间的差异，而且对于指导蓝莓的品种选育、市场推广以及产品的开发利用具有重要的指导意义。通过开发蓝莓关键风味物质的分析方法，可以为蓝莓上述研究提供重要方法支撑。

  蓝莓香气是由初级和次级代谢途径衍生的复杂挥发性有机化合物的独特组合形成，通常由脂肪酸、氨基酸和碳水化合物等生物分子作为前体物质，它们不仅能够反映蓝莓的营养价值，也是其独特风味的关键因素。挥发性风味物质是香气的重要组成部分，蓝莓的香气主要受挥发性物质影响。水果中的风味物质主要包括醛类、醇类、酯类、酸类、酮类、萜烯类以及少量含硫化合物。这些化合物共同构成了蓝莓果实的复杂香气，赋予其丰富的宜人风味，如新鲜绿色、果香、花香以及类似茶的香味等。过往的研究表明，萜烯类化合物、C6醛和醇类是蓝莓中主要的挥发性风味化合物。芳樟醇是主要来源于碳水化合物分解的芳香活性挥发性物质，在塑造蓝莓独特风味方面发挥着至关重要的作用。其赋予的清甜花香特性，是蓝莓香气中不可或缺的组成部分。醛类化合物，如具有“草本”和“叶”香气特征的2-(E)-己烯醛，在区分不同蓝莓品种的香气特征中起着关键作用。此外，香叶醇、橙花醇、正辛醇等其他挥发性化合物，对蓝莓的“甜香”、“花香”、 “果香”、 “浆果”和“蜡质”香气的形成具有显著贡献。这些挥发性化合物不仅与新鲜蓝莓果实的香气直接相关，而且它们的数量和含量是决定蓝莓整体品质的关键因素。在蓝莓果实的化学成分研究中，已广泛观察到高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum）和兔眼蓝莓（Vaccinium virgatum）中挥发性有机化合物（VOCs）的主要成分为C6化合物。这些化合物包括己醛、(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛、(Z)-3-己烯醇和(E)-2-己烯醇，它们与'新鲜绿色'和'草本'的风味特性密切相关。此外，萜烯醇类物质也在这些果实中被检测到，进一步丰富了气相气谱。相比之下，野生低丛蓝莓的挥发性成分则以酯类化合物为主，例如2-甲基丙酸甲酯、乙酸甲酯和丁酸甲酯等，这些酯类化合物对果实的“果香”贡献显著。

  蓝莓挥发性风味物质的分析依赖于精确的提取和分析技术。蓝莓最常用的挥发性提取技术包括液-液萃取（LLE）、溶剂辅助蒸发法（SAFE）以及顶空固相微萃取（HS-SPME）。固相微萃取法在蓝莓挥发性物质研究中被广泛采用，尤其是静态顶空采样模式。该技术将吸附、浓缩、解吸和进样过程集于一体，操作简便、选择性高、样品用量少、准确度高、快速灵敏且重现性好。目前，SPME技术已被广泛应用于食品科学、香料化学以及环境监测等多个领域。另一方面，目前蓝莓挥发性成分的检测技术主要采用气相色谱-质谱法（GC-MS）。随着科技的发展，分辨率和灵敏度更高、扫描速度更快的气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC/Q-TOF-MS）开始在风味成分检测领域展现出其独特的优势。GC/Q-TOF-MS技术采用全扫描模式，能够在极短的时间内对大量化合物进行快速分析，特别适合于复杂样品中未知成分的结构解析。该技术的应用范围已经扩展到水果、中药、香豆蔻等挥发性物质的鉴定。在HS-SPME与GC/Q-TOF-MS技术结合使用时，可以同时对多种挥发性化合物进行提取和分析。然而，目前关于HS-SPME-GC/Q-TOF-MS技术在蓝莓挥发性化合物鉴定中的参数优化尚未得到充分的研究和开发。因此，为了提高蓝莓挥发性化合物分析的精确性和有效性，必须开发和优化一种高分辨率质谱法。

  本研究旨在实现以下目标：(I) 对HS-SPME技术进行优化，以提高蓝莓挥发性风味物质的萃取效率和分析准确性。(II) 利用HS-SPME-GC/Q-TOF-MS技术，对23个蓝莓品种的挥发性风味物质进行深入分析。(III) 通过计算气味活性值（OAV），识别具有显著气味贡献的特征风味化合物。本研究的发现预期将显著增进我们对不同蓝莓品种中挥发性化合物组成和含量多样性的理解，从而丰富蓝莓香气的化学理论基础。此外，研究成果将为蓝莓品种的选育、品质评价和调控提供重要的分析方法支撑，有助于促进蓝莓产业的开发利用和品质提升。

  1 实验部分

  1.1 材料、仪器和试剂

  本研究选用了23个新鲜蓝莓品种作为研究对象，并制作了混合样品用于分析方法开发，这些样品是由中国辽宁省果树研究所（121°62‘E，38°92’N）提供。根据品种类别和地理起源，这些蓝莓品种被分为三个主要类别：9个南高丛蓝莓品种，包括""Emerald""、""Jewel""、"Misty"、"Farthing"、"Suxiblue"、"F6"、"Spring high"、"Ventura"和"Cooper"；9个北高丛蓝莓品种，包括"Legacy"、"Eureka"、""Northblue""、"Earliblue"、"`Ozarkblue"、"`"NanDa""、"L517"、"L521"和"L519"；以及5个南北丛杂交种品种，包括"L503"、"L504"、"L511"、"L513"和"L514"。特别指出，带有数字编号的蓝莓品种是由辽宁省果树研究所培育，目前仍处于品种培育和优化阶段。所有品种均在相同的栽培条件下生长。

  在样品的采集过程中，精心挑选了成熟度一致且无物理损伤或微生物感染的果实。果实采集后，立即使用液氮进行冷冻处理，随后存放于-80℃的冰箱中以保持其新鲜状态，测试前将各品种间充分混匀使用匀浆机捣碎，放入-80℃冰箱中备用。

  本研究中使用的纯水购自娃哈哈集团有限公司（杭州，浙江，中国），氯化钠试剂购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国），内标物2-甲基-3-庚酮和正烷烃标准品（C5-C32）购自AnPu实验技术有限公司（上海，中国）。

  实验所用的20 mL顶空瓶采购自Gerstel GmbH & Co. KG（德国）。SPME技术中使用的100μm羧基-二乙烯基苯-聚二甲基硅氧烷（CAR-DVB-PDMS）涂层纤维由Supelco, Inc.（Bellefonte, PA, USA）提供。气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7250 GC/Q-TOF）购自美国Agilent公司。DB-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）购自美国Agilent公司。

  1.2 HS-SPME样品前处理

  本研究中挥发性化合物的萃取方法是基于Zhang等人（2024）的杨梅萃取技术，并进行了适当的修改。然后，使用CAR-DVB-PDMS涂层的SPME萃取纤维，旨在通过单因素分析方法对SPME技术中的四个关键参数进行系统优化。

  将均质后的蓝莓样品（2 g）置于20ml的螺旋顶空瓶中，随后加入2ml饱和食盐水溶液及200µL的2-甲基-3-庚酮（10 mg/mL）内标溶液。接着，使用聚四氟乙烯（PTFE）硅胶隔膜密封顶空瓶。利用Gerstel SPME自动进样器，将顶空瓶置于自动振荡器上，在500 rpm的搅拌速率下，于50℃孵化15min。之后，将经老化处理的SPME萃取纤维插入密封的顶空瓶中，推出纤维头，使SPME纤维头在50℃的萃取温度下连续加热和搅拌30min，以实现目标化合物的有效提取和吸附。萃取过程完成后，将SPME纤维取出，并迅速引入至GC进样口进行热解吸，持续3min。在优化过程中，每次仅改变一个实验参数，而其他参数则维持在之前优化所得的最佳水平，以确保实验的系统性和可比性。

  1.3 GC-Q-TOF仪器条件

  挥发物的分离和鉴定采用Agilent 7890B-7250 GC/Q-TOF-MS气相色谱质谱仪。本研究中的GC/Q-TOF-MS条件按照Di Ma和Zhang的描述进行。

  气相（GC）色谱条件：气相色谱柱为 DB-5 MSUI 毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 µm）；载气为氦气（纯度≥99.99%），流速为 1 mL/min；溶剂延迟3 min，以保护离子源灯丝。柱温箱升温程序：初始温度40°C，保持 2 min，以 5°C/min 的速度升至 280°C，保持 10 min；不分流模式进样，运行时间60min。

  质谱（MS）条件：进样口温度250℃；电离方式EI,电子轰击能量 70 eV，离子源温度 250℃；传输线温度 250℃；检测器电压 1000 e V；发射电流 5µA；，扫描质量范围33-500 amu。

  1.4 挥发性化合物的定性和定量分析

  完成GC/Q-TOF-MS分析后，采用Agilent未知物分析软件对获得的原始质谱数据进行处理，将其转换成SureMass格式。随后，进行了解卷积处理，以提高数据的解析度。将处理后的数据与美国国家标准与技术研究所（NIST）维护的质谱库（2017版）进行匹配，利用保留指数（RI）进一步验证化合物的识别结果，选择匹配因子高于75的化合物进行初步检索。采用正构烷烃系列标准品（C5至C32）在相同的色谱条件下进行测定，以确定化合物的保留指数。

  本研究采用内标法对蓝莓中的挥发性化合物浓度进行了定量分析。使用2-甲基-3-庚酮溶液作为内标物质，以此来测定各种挥发性成分的含量。定量分析的计算公式如下：各成分的含量/（μg/kg）=（A1/A2）×（M1/M2）×1000，其中，A1和A2分别代表检测成分和内标的色谱峰面积；M1和M2分别对应内标和样品的质量。此外，气味活性值（OAV）是通过将化合物的浓度与其气味阈值进行比较来计算的，OAV是用于评估各挥发性风味化合物对整体风味的贡献程度。当OAV大于1时，表明该化合物在风味中起到显著作用。

  1.5 统计分析

  使用 Agilent MassHunter Unknowns Analysis软件对质谱进行SureMass分析，进行NIST谱库匹配和保留指数（RI）比较。使用Excel 2016 软件和Origin 2021软件进行统计分析和数据可视化。采用代谢分析仪6.0 （https://www.metaboanalyst.ca/）进行HCA和PCA分析。

  2 结果与分析

  2.1 盐效应

  2.1.离子强度的影响

  本研究部分旨在探讨不同NaCl溶液质量分数对SPME萃取结果的影响。众所周知，添加NaCl会改变样品的离子强度，进而影响目标组分在水相和SPME涂层之间的分配系数，这是影响SPME萃取效率的关键因素。因此，本研究对盐析效应进行了优化，考察了NaCl溶液质量分数在五个不同水平：0%、6.6%、13.2%、19.8%和26.4%（饱和对蓝莓香气物质的化合物总数（TN）和总峰面积（TA）的影响。实验结果表明（图1），随着NaCl溶液质量分数的增加，萃取得到的总峰面积（TA）呈现出先增加后减小的趋势，而化合物总数（TN）则呈现出明显的上升趋势。这一现象可能是由于盐析效应减少了风味物质在基质中的溶解度，促使更多的挥发性物质挥发到样品瓶的顶空中，从而提高了SPME的萃取效率。具体而言，当NaCl溶液质量分数为19.8%时，总峰面积（TA）达到最大值（1.89×109），但化合物总数（TN）相对较少（103）。而当NaCl溶液质量分数增至26.4%（饱和）时，化合物总数（TN）达到最高，从0 g/mL时的99增加至112，此时的总峰面积（TA）为1.41×109。此外，在26.4%（饱和）NaCl溶液条件下，醇类、酚类和酯类化合物的数量和峰面积均显著高于其他实验条件。综合考虑，后续实验将采用26.4%（饱和）的NaCl溶液进行SPME萃取。

 

  2.2 萃取温度的影响

  萃取温度是影响SPME萃取过程中风味物质吸附量及萃取效率的关键参数。理论上，萃取温度对萃取过程具有双重作用：一方面，它能够增加分析物在样品体系中的扩散系数，从而提高萃取效率；另一方面，过高的温度可能导致挥发性物质的损失或热降解。因此，本研究中萃取温度的设置未超过80℃。实验结果表明，不同萃取温度对蓝莓挥发性化合物的萃取具有显著影响。如图2中所示，在30-50°C的范围内，随着温度的升高，化合物的数量和总峰面积（TA）整体呈现出持续上升的趋势，并在50℃时达到峰值。特别是在50℃时，萜烯类化合物的数量和峰面积亦达到最大值。这可能是因为温度的升高增加了分析物的热运动，促进了挥发性化合物从样品基质中的释放，从而增加了顶空中的化合物浓度，这一趋势与Di Ma 等人的结果相一致。然而，当萃取温度从50℃进一步升高至70℃时，观察到化合物的数量和总峰面积有所减少。这一现象可能是由于过高的温度降低了挥发性物质在SPME涂层上的分配系数，导致化合物更倾向于保留在水相中而非被涂层吸附。此外，过高的温度还可能引起挥发性成分之间的化学反应，这可能会改变样品的真实香气特征。因此，本研究确定50℃为最佳的萃取温度。

 

 

  2.3 萃取时间的影响

  SPME是一个基于分配平衡的过程，其中萃取时间是决定目标分析物在吸附涂层与样品体系之间分配速率的关键因素。当目标分析物在二者之间达到平衡状态时，将实现最大的萃取吸附量，此时萃取效率达到最优。因此，萃取时间对SPME的效率具有重要影响。本实验通过分析蓝莓样品在不同萃取时间（10、20、30、40、60min）下的TN和TA，以确定最佳的萃取时间。从图3中可以看出，随着萃取时间的延长，挥发性化合物的TN和TA均呈现出先增加后减少的趋势。这一现象可能是由于挥发性物质在涂层纤维上的吸附与解吸之间的动态竞争作用。在初期阶段，萃取时间的延长有利于挥发性物质占据涂层纤维上的吸附位点，直至样品液和吸附相接近平衡状态。然而，随着萃取时间的进一步延长，为了维持分配平衡，挥发性组分可能从涂层纤维向样品溶液发生逆行扩散，导致萃取效率下降。实验数据显示，在30min的萃取时间下，挥发物的TN和TA达到最高值，表明此时萃取瓶内两相达到了平衡状态，且萃取效果最佳。因此，选择30min作为最佳的SPME萃取时间。

 

  2.4 预热时间的影响

  在SPME萃取过程中，样品在顶空瓶中的预热步骤是实现挥发性成分在顶空中达到动态平衡的关键环节，这对萃取纤维头的吸附量和达到吸附饱和的时间具有显著影响。预热不仅有助于挥发性物质从基质中释放，还能促进其在顶空中的均匀分布。由图4可知，在预热时间介于 5～ 30 min的范围内，化合物总数TN）随预热时间的延长呈现出波动变化的趋势，并在15 min时达到峰值。这一发现与Shouhui Wei等人的研究结果相一致，即过长的预热时间可能导致热稳定性较低的物质发生分解，从而影响分析结果的准确性。尽管总峰面积（TA）在30 min的预热时间下达到最大值，但在15 min预热时，萜类和醛类化合物的总峰面积显著更高。综合考虑实验结果和时间成本，本研究选择15 min作为最佳的预热时间。

 

  2.5 与文献中萃取化合物数量的比较

  根据先前实验的优化结果，我们确定了HS-SPME用于测定蓝莓样品中香气组分的最佳萃取条件：使用饱和NaCl溶液（26.4% w/v）来调节样品的离子强度，萃取温度设置为50℃，萃取时间固定为30min，预热时间设定为15min。在这些最佳条件下，我们对蓝莓样品进行了重复分析。

 

  本研究通过优化HS-SPME技术，对蓝莓样品中的香气组分进行了深入分析。通过与现有文献中报道的几种前处理方法进行比较，我们发现优化后的HS-SPME技术在挥发性化合物的总数量和关键组分的数量上均有显著提升。具体而言，本研究共检测出318种挥发性风味化合物，这一数量大约是其他文献报道的化合物数量的三倍（见表1）。

  在关键风味化合物的比较分析中，优化后的HS-SPME方法成功萃取出39种关键风味化合物（见图5），这一数字明显高于其他文献中的报道。这一差异可能源于不同文献中所采用的蓝莓品种及样品处理方式的不同，这些因素均可能对化合物的提取效率和种类产生影响。醛类、萜烯类物质是蓝莓中最重要的风味成分，其次是醇类、酮类、烃类、酚类和杂环化合物。然而，综合比较各项研究结果，本研究采用的HS-SPME技术显示出更高的萃取效率，能够更全面地揭示蓝莓香气的化学组成，为理解蓝莓的香气指纹提供了更为丰富的信息。

  3 结论

  本研究以蓝莓为研究对象，采用单变量分析方法，针对SPME技术进行了系统的参数优化，以确定最优的操作条件。SPME技术已被证实能够有效地从蓝莓样品中快速提取挥发性风味物质。通过SPME-GC/Q-TOF-MS技术，对蓝莓中的318种挥发性风味物质进行了鉴定和定量分析，是其他文献报道的蓝莓挥发性风味物质数量的3倍，全面揭示了蓝莓的香气指纹构成。这些风味物质包括了酯类、醛类、萜类、酮类、醇类、杂环类、酸类和酚类等。醛类、萜烯类物质是蓝莓中最重要的风味成分，其次是醇类、酮类、烃类、酚类和杂环化合物。其中，2-己烯醛和芳樟醇被鉴定为含量最丰富的挥发性风味物质。通过OAV＞1共鉴定出39种关键风味化合物，表明它们对蓝莓的风味具有显著的影响，其中对蓝莓风味贡献较大的是正己醛、2-己烯醛、芳樟醇、香叶醇、己醇等。本研究为今后杨梅风味品质的评价提供了方法基础。