蓝莓种质资源鉴定与新种质创制岗位
魏鑫 王升 王兴东 杨玉春 刘有春 刘成
摘要：为探究蓝莓对低温处理的生理响应，筛选抗寒性评价指标并综合评价蓝莓品种的抗寒性。以‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’5个蓝莓品种1年生枝为试材，研究低温处理（-10、-15、-20、-25、-30、-35和-40°C）对其相对电导率，过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）、游离脯氨酸含量的影响，同时测定可溶性糖、还原糖、可溶性蛋白、淀粉、纤维素、果糖、葡萄糖、蔗糖、总含水量、自由水含量并计算束缚水含量、自由水含量/总含水量和束缚水含量/总含水量，采用主成分分析法对不同蓝莓品种的抗寒性进行综合评价。结果表明，随着温度的降低，5个蓝莓品种枝条的相对电导率、MDA含量逐渐升高，呈“S”形变化曲线；POD、SOD活性呈单峰变化趋势；游离脯氨酸含量随处理温度的降低呈逐渐上升的变化趋势；‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’3个品种具有较高的可溶性总糖、还原糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素和可溶性蛋白含量；‘美登’具有较低的总含水量、自由水含量和自由水/总含水量。‘密斯梯’具有较高的总含水量、自由水含量和自由水/总含水量以及较低的束缚水含量/总含水量。可以将相对电导率、MDA、蛋白质、还原糖、可溶性总糖、果糖、自由水、束缚水含量和POD活性作为评价蓝莓品种抗寒性强弱的指标。通过综合分析可确定供试5个蓝莓品种的抗寒性由强到弱依次为‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’。
关键词：蓝莓；低温处理；生理响应；抗寒性；
蓝莓学名越橘，属于是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物，由于其果实中富含花青素等营养保健功能成分，具有很高的经济价值和广阔的开发前景的新兴小浆果果树，目前成为全球发展最快的果树树种。由于我国现在栽培的多数蓝莓品种来源于美国、加拿大等地，其适宜栽培区域气候条件较为温和，即使冬季温度较低但空气湿度相对较高，而我国东北地区冬季严寒、气候干燥。我国北方地区种植蓝莓时，冬季需进行防寒保护才能安全越冬，不仅增加了生产成本与工作量，而且在防寒过程中树体易受损伤，造成减产，蓝莓的抗寒性问题已成为限制该产业持续发展的主要因素之一。因此，鉴定、评价蓝莓品种的抗寒性与抗寒机理对于筛选抗寒品种适地适栽推广、抗寒品种的挖掘利用、栽培区域合理布局与规划设计、防寒措施的制定等均具有重要意义。
目前蓝莓抗寒性研究主要从品种类型的抗寒性差异，质膜透性、组织结构、组织含水量、膜脂过氧化、保护酶系统等抗寒生理机理以及功能基因挖掘等方面进行的。抗寒性强的品种相对电导率的变化相对平缓，枝条中果糖和葡萄糖浓度与抗寒性水平呈显着正相关，丙二醛含量与抗寒性呈负相关。蓝莓休眠期花芽在受到低温胁迫时，随着温度的降低，花芽的电解质渗出率、渗透调节物质以及过氧化物酶的活性总体上呈现规律性变化。脯氨酸的积累有助于增强蓝莓抵御严寒的能力，保护酶酶活性、可溶性糖和脱落酸含量与越冬过程中抗寒能力的提高具有密切关系。植物的抗寒机制非常复杂，需要将多种抗寒指标结合起来系统的分析和评价，才能更客观地反映蓝莓的抗寒性。因此，本试验利用抗寒性存在差异的不同品种类型蓝莓为试材，通过田间调查和人工模拟低温环境相结合的方法开展抗寒性研究，通过质膜透性、丙二醛含量、保护酶活性、渗透调节物质、纤维素含量、总含水量、自由水及束缚水含量等抗寒相关指标的综合分析和评价，以期明确蓝莓树体受冻后的生理反应机制，揭示抗寒品种抗性机理。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试品种为：7年生矮丛品种‘美登’、半高丛品种‘北陆’、北高丛品种‘蓝丰’、南高丛品种‘密斯梯’和兔眼品种‘精华’。供试材料定植于辽宁省果树科学研究所蓝莓资源圃塑料大棚内，采取常规管理措施。
1.2 试验方法
1.2.1 取样与材料处理
选取经过抗寒锻炼5个品种植株上不同方向且完全木质化直径为0.3-0.5cm的1年生枝。一部分用于不同低温处理，处理温度为:-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃及对照（4℃冰箱冷藏保存），冷冻时温度下降幅度和解冻时的温度回升幅度都为5℃/h，冷冻到达处理所需温度后，维持24h，然后解冻。测定相对电导率、丙二醛含量、保护酶活性和游离脯氨酸含量。一部分，烘箱120℃杀青20min后，80℃烘干至恒重，粉碎成粉末后用于测定可溶性总糖、还原糖、淀粉、可溶性蛋白、糖组分与含量以及纤维素含量，一部分用于测定枝条总含水量、自由水含量并计算束缚水含量、自由水含量/总含水量和束缚水含量/总含水量，每处理3次重复，每次重复10个枝条。
1.2.2 测定指标与方法
电解质渗透率采用电导率仪法测定；丙二醛含量采用TBA显色法测定；过氧化物酶活性采用愈创木酚法测定；超氧化物酶活性氮蓝四唑光还原法测定；游离脯氨酸含量采用硝基水杨酸测定；可溶性糖、还原糖、淀粉、纤维素含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定；糖组分与含量采用高效液相色谱法；总含水量、自由水和束缚水含量采用烘干称重法和阿贝折射仪测定。
1.2.3 统计分析
试验数据采用Excel2007软件进行数据预处理，采用Origin 2018制图，应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和主成分分析，采用Duncan检验差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 低温处理对5个蓝莓品种枝条相对电导率的影响
5个品种在试验低温范围内，相对电导率随处理温度的降低逐渐升高并呈“S”型变化。5个品种相对电导率随温度降低变化的速率有所不同。‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’品种相对电导率随温度的降低变化较为平缓。‘密斯梯’和‘精华’2个品种在-25℃后相对电导率明显提高。-40℃时，‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘密斯梯’‘精华’5个品种相对电导率较4℃时分别增加了1.02、1.20、1.17、2.56和2.45倍。
4℃条件下，5个品种枝条相对电导率最低，‘密斯梯’相对电导率显著高于‘精华’‘美登’，与‘蓝丰’‘北陆’差异不显著。‘密斯梯’‘蓝丰’‘美登’和‘北陆’间差异不显著；-40℃处理下，5个品种枝条相对电导率均最高，‘密斯梯’相对电导率显著高于其他4个品种，‘精华’显著高于‘蓝丰’‘美登’和‘北陆’，‘蓝丰’与‘北陆’间差异不显著，但均显著高于‘美登’（图1）。
2.2 低温处理对5个蓝莓品种枝条丙二醛含量的影响
5个品种在试验低温范围内，丙二醛含量随处理温度的降低逐渐升高并呈“S”型变化。4℃时，‘美登’枝条丙二醛含量显著低于其他温度的，-40℃时显著高于其他温度；4℃时，‘北陆’‘蓝丰’枝条丙二醛含量与15℃差异不显著，但显著低于其他温度，-40℃时显著高于其他温度；4℃时，‘密斯梯’枝条丙二醛含量显著低于其他温度，-40℃时显著高于其他温度，-20℃、-25℃和-30℃之间差异不显著；4℃时，‘精华’枝条丙二醛含量与15℃差异不显著，但显著低于其他温度。由-20℃开始，随温度的降低，枝条丙二醛含量显著升高（数据未显示）。
‘密斯梯’品种在各温度处理条件下，均显著高于其他4个品种，‘精华’显著高于其他3个品种。4℃和-15℃时，‘北陆’与‘蓝丰’间差异不显著但均显著高于‘美登’；-30℃、-35℃和40℃时，‘蓝丰’显著高于‘北陆’和‘美登’，‘美登’和‘北陆’间差异未达显著水平（图2）。
2.3 低温处理对5个蓝莓品种枝条过氧化物酶（POD）活性的影响
5个品种在试验温度范围内均成单峰变化趋势，但出峰温度有所不同。‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’3个品种在-30℃时，POD活性达到最高，极显著高于其他温度。‘密斯梯’和‘精华’2品种在-25℃时，POD活性达到最高，极显著高于其他温度。4℃时，‘美登’枝条POD活性极显著低于其他温度。-15℃、-40℃极显著低于除4℃外的其他温度，两者间差异达显著水平；不同温度下‘北陆’蓝莓枝条POD活性由低到高依次为4℃、-15℃、-40℃、-20℃、-35℃、-25℃、-30℃，除-35℃和-25℃间差异不显著外，其余温度间差异均达极显著水平；4℃和-40℃时，‘蓝丰’蓝莓枝条POD活性极显著低于其他温度，两者间差异不显著；4℃、-40℃、-15℃和-35℃时，‘密斯梯’蓝莓枝条POD活性极显著低于-30℃、-20℃和-25℃；‘精华’蓝莓枝条POD活性由低到高依次为4℃、-40℃、-15℃、-30℃、-20℃、-35℃、-25℃，各温度间差异均达到极显著水平（数据未显示）。
在各温度条件下，‘美登’POD活性极显著高于其他4个品种，‘北陆’和‘蓝丰’均极显著高于‘密斯梯’和‘精华’。在-15℃、-30℃条件下，‘北陆’和‘蓝丰’间差异不显著外，其他低温条件下‘北陆’均显著高于‘蓝丰’；4℃、-30℃和-40℃条件下，‘精华’显著高于‘密斯梯’。-15℃、-20℃和-35℃条件下，‘精华’极显著高于‘密斯梯’。在-25℃条件下，‘密斯梯’和‘精华’间差异不显著（图3）。
2.4 低温处理对5个蓝莓品种枝条超氧化物酶（SOD）活性的影响
5个品种在试验温度范围内均成单峰变化趋势，但出峰温度有所不同。‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’3个品种在-30℃时，SOD活性达到最高，极显著高于其他温度。‘密斯梯’和‘精华’2品种在-25℃时，SOD活性达到最高，‘密斯梯’品种极显著高于其他温度，而‘精华’品种显著高于其他温度。4℃时，除‘密斯梯’枝条SOD活性与-40℃差异未达显著水平，但极显著低于其他温度外，其余4个品种均为极显著低于其他温度。-40℃时，‘美登’枝条SOD活性极显著低于-20℃、-25℃和-30℃，显著低于-35℃，与-15℃差异不显著。‘蓝丰’枝条SOD活性与-15℃差异不显著，但极显著低于其他温度。‘密斯梯’‘精华’2品种枝条SOD活性与-35℃差异未达显著水平，但极显著低于其他温度（数据未显示）。
4℃条件下，‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’显著高于‘密斯梯’和‘精华’，‘美登’‘北陆’‘蓝丰’以及‘密斯梯’和‘精华’间差异不显著；-25℃条件下，‘美登’显著高于‘北陆’‘密斯梯’和‘精华’，与‘蓝丰’间差异不显著，‘蓝丰’显著高于‘密斯梯’和‘精华’，与‘北陆’间差异不显著；-30℃条件下，‘美登’显著高于其他4个品种，‘北陆’和‘蓝丰’显著高于‘密斯梯’和‘精华’，‘北陆’‘蓝丰’以及‘密斯梯’和‘精华’间差异不显著；-40℃条件下，‘美登’显著高于‘北陆’‘密斯梯’和‘精华’，与‘蓝丰’间差异不显著，‘蓝丰’显著高于‘密斯梯’和‘精华’，与‘北陆’间差异不显著（图4）。
2.5 5个蓝莓品种枝条渗透调节物质及纤维素含量的差异
5个品种在试验低温范围内，游离脯氨酸含量随处理温度的降低呈逐渐上升的变化趋势。4℃时，‘美登’枝条游离脯氨酸含量与-15℃和-20℃差异不显著，但显著低于其他温度。‘北陆’枝条游离脯氨酸含量与-15℃差异不显著，但显著低于其他温度。随处理温度降低，枝条游离脯氨酸含量显著升高，不同温度间差异达均显著水平。‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’3个品种枝条游离脯氨酸含量均显著低于其他温度；-40℃时，5个品种枝条游离脯氨酸含量均显著高于其他温度（数据未显示）。
4℃条件下，‘美登’显著高于另4个品种。‘蓝丰’‘北陆’显著高于‘密斯梯’，但与‘精华’差异不显著；-40℃条件下，‘北陆’显著低于‘美登’，显著高于‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’，‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’间差异未达显著水平（图5）。
5个品种可溶性总糖、还原糖由高到低依次为‘北陆’‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’，5个品种的可溶性总糖、还原糖含量差异均达显著水平；‘北陆’品种淀粉含量极显著高于另4个品种，‘美登’极显著高于‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’，‘蓝丰’和‘精华’间差异未达显著水平，但均极显著高于‘密斯梯’；‘北陆’‘美登’2品种的蛋白质含量极显著高于其他3个品种，‘北陆’和‘美登’间差异未达到显著水平。‘蓝丰’与‘精华’间差异未显著水平，但均极显著高于‘密斯梯’；‘美登’‘北陆’‘蓝丰’3个品种的果糖含量差异未达显著水平，但极显著高于‘密斯梯’和‘精华’，‘密斯梯’和‘精华’间差异达极显著水平；‘北陆’品种葡萄糖含量显著高于‘密斯梯’和‘精华’，与‘美登’和‘蓝丰’间差异未达显著水平。‘美登’和‘蓝丰’显著高于‘密斯梯’，与‘精华’差异未达显著水平。‘密斯梯’和‘精华’间差异未达显著水平；‘美登’品种蔗糖含量显著高于其他4个品种，‘密斯梯’显著低于其他4个品种，‘北陆’显著高于‘蓝丰’和‘精华’，而‘蓝丰’和‘精华’间差异未达显著水平；‘北陆’显著高于其他4个品种；‘美登’显著高于‘密斯梯’和‘精华’，与‘蓝丰’差异不显著；‘蓝丰’显著高于‘精华’，与‘密斯梯’差异不显著；‘密斯梯’与‘精华’间差异不显著（表1）。
2.6 5个蓝莓品种枝条含水量的差异
‘密斯梯’品种枝条总含水量极显著高于另4个品种，‘精华’‘蓝丰’和‘北陆’之间差异不显著但均极显著高于‘美登’；‘密斯梯’品种枝条自由水含量极显著高于另4个品种，‘蓝丰’和‘精华’2品种极显著高于‘美登’，显著高于‘北陆’，‘美登’‘北陆’间差异未达显著水平；‘北陆’‘蓝丰’和‘精华’束缚水含量极显著高于‘美登’和‘密斯梯’，‘美登’极显著高于‘密斯梯’；‘密斯梯’自由水含量/总含水量显著高于另外4个品种，4个品种之间差异未达显著水平；‘密斯梯’束缚水含量/总含水量显著低于另外4个品种，4个品种之间差异未达显著水平（图6）。
2.7 蓝莓抗寒性的综合分析
对‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘密斯梯’和‘精华’5个蓝莓品种的18个抗寒生理指标进行主成分分析。前3个主成分方差累积贡献率达97.63%。表明这3个主成分可以反映绝大部分原始信息，因此，可以用这3个主成分对5个蓝莓品种的抗寒性进行综合分析（表2）。
前3个主成分的各指标在蓝莓抗寒能力中所起的作用有所不同。第1主成分的特征值为13.988，方差贡献率为77.710%，SOD活性、相对电导率和MDA、游离脯氨酸、蛋白质、淀粉、纤维素、还原糖、可溶性总糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、总含水量、自由水含量以及自由水/总含水量、束缚水/总含水量载荷值较大，其中MDA含量、相对电导率、总含水量、自由水含量和自由水/总含水量为负向，其余为正向。若选择载荷值绝对值为0.95以上，则相对电导率、MDA、蛋白质、还原糖、可溶性总糖、果糖、自由水含量可以作为第1主成分的代表特征向量；第2主成分的特征值为2.349，方差贡献率为13.051%，POD活性、束缚水含量载荷值较大，POD活性为正向，束缚水含量为负向，载荷值在0.78以上；第3主成分的特征值为1.237，方差贡献率为6.871%，具有较大载荷值的指标为淀粉和纤维素含量，载荷值在0.40以上（表2、表3）。
对18个抗寒生理指标进行降维处理，使数据标准化并保留3个主成分，用f1、f2和f3分别代表前3个主成分，Zx1-Zx18分别代表MDA含量等18个指标消除量纲得到标准化的数据，利用主成分的特征值和因子载荷计算各综合指标系数，得到3个主成分分值的表达式，如下：
主成分值1：f1=-0.26×Zx1+0.15×Zx2×Zx3-0.26×Zx4+0.21×Zx5+0.26×Zx6+0.22×Zx7+0.2×Zx8+0.26×Zx9+0.27×Zx10+0.26×Zx11+0.23×Zx12+0.25×Zx13-0.25×Zx14-0.25×Zx15+0.14×Zx16-0.24×Zx17+0.24×Zx18
主成分值2：f2=0.08×Zx1+0.51×Zx2+0.02×Zx3-0.07×Zx4+0.41×Zx5+0×Zx6-0.06×Zx7+0.14×Zx8-0.07×Zx9-0.02×Zx10-0.01×Zx11-0.18×Zx12+0.16×Zx13-0.13×Zx14+0.11×Zx15-0.54×Zx16+0.24×Zx17-0.24×Zx18
主成分值3：f3=0.19×Zx1-0.27×Zx2+0.13×Zx3-0.06×Zx4-0.09×Zx5-0.15×Zx6+0.38×Zx7+0.56×Zx8+0.17×Zx9+0.07×Zx10+0.12×Zx11+0.33×Zx12-0.12×Zx13+0.24×Zx14+0.23×Zx15-0.14×Zx16+0.21×Zx17-0.21×Zx18
以所选取的第1-3主成分的特征值和主成分值构建综合评价模型：F=(13.988×f1+2.349×f2+1.237×f3)/(13.988+2.349+1.237)，其中，F为综合评价指标，计算得出5个品种不同低温处理的综合评价值F，利用主成分分析综合评价抗寒性根据综合评价值的大小判断抗寒性强弱，得分值越高则抗寒性越强（表4）。
5个品种f1由高到低依次为‘北陆’‘美登’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’，f2由高到低依次为‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’，f3由高到低依次为‘北陆’‘美登’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’；综合评价变量F值由高到低依次为，‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’，由此可见，5个蓝莓品种的抗寒性由强到弱依次为‘美登’＞‘北陆’＞‘蓝丰’＞‘精华’＞‘密斯梯’（表4）。
3 结论与讨论
3.1 不同类型蓝莓品种低温处理下质膜透性间的差异
在低温处理过程中，活性氧自由基积累，电解质外渗，MDA大量积累，造成细胞膜系统的损伤。本研究发现，在实验低温范围内，5个品种枝条相对电导率和MDA含量随处理温度的降低而呈逐渐升高的趋势。‘密斯梯’和‘精华’相对电导率和MDA含量明显升高，‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’相对电导率和MDA含量升高的速度相对平缓，说明‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’3个品种细胞膜系统受害程度低于‘密斯梯’和‘精华’。
3.2 不同类型蓝莓品种低温处理下保护酶活性间的差异
植物体内酶活性的变化能够反映植物在低温处理后受伤的程度，POD和SOD是植物体内重要的保护酶，与抗寒性有着密切的关系。刘兴禄研究发现5个苹果砧木枝条的POD和SOD酶活性随着温度的降低变呈先升后降的规律，抗寒性较强的品种受低温处理时酶活性增加幅度大。本研究发现，在实验低温范围内，5个品种枝条POD、SOD活性随处理温度降低呈单峰变化趋势，说明轻度低温处理下，参试品种通过提高酶活性来减轻低温处理的伤害。随着胁迫程度的增加，活性氧积累超过保护酶系统的清除能力，进而对抗氧化酶系统造成伤害导致其活性下降。‘密斯梯’枝条酶活性的变化较另4个品种更为平稳，‘美登’枝条酶活性的变化较另4个品种更为迅速，且活性较高，可以快速清除超氧阴离子自由基和过氧化氢等活性氧，进而来维持细胞的稳定。
3.3 不同类型蓝莓品种渗透调节物质及纤维素含量间的差异
渗透调节作用是植物抵御逆境的重要生理机制，植物通过合成、积累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质提高细胞的渗透浓度，降低水势，增强植株的保水能力，从而提高抗寒性。本研究发现，‘美登’‘北陆’和‘蓝丰’3个品种具有较高的可溶性总糖、还原糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素和可溶性蛋白含量，当受到低温处理时，其体内较高的渗透调节物质含量促使细胞渗透势的下降，加强细胞吸水和保水能力，保证原生质不会脱水凝固，进而增强树体对低温的抗性。
3.4 不同类型蓝莓品种组织含水量间的差异
植物在遭受低温处理时，组织发生结冰，造成细胞死亡，因此避免细胞内结冰是植物抗寒性的重要机制，植物的抗寒能力与体内的水分变化息息相关。束缚水有助于保持原生质胶体及大分子结构的稳定性，有利于植物抗寒性的增强，自由水占总含水量百分比越大则代谢越旺盛，抗性降低。抗寒性强的桃品种可大幅提高束缚水与自由水比值以应对低温胁迫。番茄能通过降低自由水含量、增加束缚水含量来降低自身代谢活性，减轻低温伤害。‘美登’由于具有较低的总含水量、自由水含量和自由水/总含水量进而增强树体的抗寒性。而‘密斯梯’由于具有较高的总含水量、自由水含量和自由水含量/总含水量以及较低的束缚水含量/总含水量，树体的抗寒性较差。
3.5 主成分分析综合评价抗寒性
果树的抗寒性是受多种因素共同影响的复杂生理生化过程，使用单一指标评价样本抗寒性时，难以全面客观地反映植物抗寒性的强弱，所以应进行抗寒性的综合评价。主成分分析是一种可以综合多个指标的贡献值来判断抗寒性的综合评价方法，能够可靠的反映植物的抗寒性。因此，在本研究中运用主成分分析的方法结合18个指标对5个不同类型的蓝莓品种进行抗寒性的综合评价。可以将相对电导率、MDA、蛋白质、还原糖、可溶性总糖、果糖、自由水、束缚水含量和POD活性作为评价蓝莓品种抗寒性强弱的指标。通过综合分析可确定供试5个蓝莓品种的抗寒性由强到弱依次为‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’。
综上所述，可以将相对电导率、MDA、蛋白质、还原糖、可溶性总糖、果糖、自由水、束缚水含量和POD活性作为评价蓝莓品种抗寒性强弱的指标。综合分析可确定供试5个蓝莓品种的抗寒性由强到弱依次为‘美登’‘北陆’‘蓝丰’‘精华’和‘密斯梯’。‘美登’抗寒性较强的原因是具有较高的POD和SOD活性，渗透调节物质含量以及较低的总含水量、自由水含量和自由水/总含水量。