质量安全与营养品质评价岗位
王娇 狄珊珊 赵慧宇 汪志威 齐沛沛 王新全
摘 要：建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定葡萄等果蔬中15种植物生长调节剂残留的方法。以葡萄为代表基质，样品使用QuEChERS法进行预处理，选用1 %乙酸乙腈溶液为提取液，无水硫酸镁和氯化钠为盐析试剂。对吸附剂种类和用量进行系统优化，选取50 mg C18和150 mg MgSO4对提取液进行净化。最终样品以Inertsil ODS-3 2 µm(75×2.10 mm)柱为分析色谱柱，0.5mmol/L甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，进行梯度洗脱，采用液相色谱-串联质谱进行分析；系统的方法验证结果表明，在6种果蔬中，除氯苯胺灵和2, 3, 5-三碘苯甲酸外，其余13种植物生长调节剂在0.5~200 µg/L的浓度范围内具有良好的线性关系（r2 ≥ 0.98）；当添加浓度为10，50，200 µg/L时，各分析物在空白果蔬样品中的添加回收率为71.3 %~116 %，RSD小于16 %，方法定量限为10 μg/kg。该方法简便、快速、灵敏、准确，可同时满足葡萄和多种果蔬中15种生长调节剂的残留量的检测。
关键词：QuEChERS；液相色谱-串联质谱法；植物生长调节剂；果蔬
植物生长调节剂对植物生长和发育阶段有重要调控作用，可促进植物生长、提高作物产品质量和品质、增强果实抗病力和延缓果实成熟等[1-5]，因此被广泛应用于果蔬生产中。如氯吡脲用于猕猴桃以促进果实肥大提高产量，多效唑用于桃生产中以促进结果，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)用于柑橘和番茄生产及采后贮藏过程中以延缓果实在贮藏中的衰老[6]。植物生长调节剂属农药范畴，其滥用或使用不当，都会对环境以及身体有危害，近年来“西瓜爆裂”及海南“乙烯利催熟香蕉”事件等滥用植物生长调节剂的情况屡见不鲜，愈来愈引起消费者恐慌，公众和食品监管部门对植物生长调节剂质量安全的关注日益增加[7, 8]。因此，各国对植物生长调节剂制定了相应的最大残留限量(MRL)标准。如中国规定氯吡脲在黄瓜、西瓜和甜瓜中的最高残留限量为0.1 mg/kg，多效唑在水果中的最高残留限量为0.5 mg/kg[9]；日本、美国、澳大利亚等也对多效唑制定了限量，在MRL值介于0.01~1 mg/kg之间 [10] [11]。
目前，国内外有关植物生长调节剂残留的检测方法主要有气相色谱及气相色谱-质联用法，液相色谱及液相色谱-串联质谱技术等[12-14]。由于大多数植物生长调节剂具有分子质量大、极性强、不易挥发或易被热分解等特性，气相色谱法和气相联用法需要进行预衍生处理，前处理繁琐。相比之下，液相色谱法操作方便，与质谱结合使用时，检出限低，定性能力强，因此成为检测多种植物生长调节剂的主要方法。研究人员相继采用高效液相色谱-串联质谱建立了豆芽[15]和白芷[16]中的植物生长调节剂。但以上检测方法检测样品单一，同时适用于多种果蔬中生长调节剂的文献鲜有有报道。
因此，本研究基于QuEChERS净化方法，以葡萄为代表基质，优化提取液、净化方法等因素，基于液相色谱-串联用法，建立了15种植物生长调节剂残留量同时测定的分析方法。以此分析方法为手段，对葡萄、苹果、番茄、草莓、黄瓜、茭白中的15种生长调节剂进行方法验证。本方法具有操作简便、灵敏、准确性好、检测效率高等优点，适用于批量、快速检测多种果蔬生长调节剂残留量。
1 实验部分
1.1 材料、仪器和试剂
葡萄、苹果、番茄、草莓、黄瓜、茭白(购自杭州市大型超市)。岛津LC-MS/MS-8050三重四极杆质谱仪，配LC-30AD液相色谱仪(日本岛津公司)；离心机(美国热电公司)；Talboys涡旋混合器(美国Talboys公司)；KQ-5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)；Primo R 低温冷冻离心机(美国Thermo公司)。乙腈和甲醇(色谱纯，德国 Merck)；甲酸(色谱纯，美国Fluka)，实验用水符GB/T6682规定要求。色谱纯甲酸铵（美国天地有限公司）；C18（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；无水硫酸镁（MgSO4）和氯化钠（NaCl）(上海凌峰化学试剂有限公司)。15种植物生长调节剂标准品：抗倒酯(Trinexapac-ethyl)、噻苯隆(Thidiazuton)、烯效唑(Uniconazole)、甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)、多效唑(Paclobutrazol)、氯苯胺灵(Chlorpropham)、氯吡脲(Forchlorfenuron)、吲哚乙酸(Heteroauxin)、6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)、脱落酸(abscisic acid)、赤霉素(Gibberellic acid)、2,4-滴丁酯(2,4-D Butyl Ester)、2,3,5-三典苯甲酸(2,3,5-Iodobenzoic acid)、对氯苯氧乙酸(4-Chlorophenoxyacetic acid)、调果酸(Cloprop)均购自Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司，纯度均大于99 %。
1.2 样品前处理
首先，准确称取10.00 g（精确至0.01 g）样品放入50mL离心管中，再加入10 mL乙酸乙腈（1 %乙酸），匀浆2min后，加入脱水试剂（6 g MgSO4和1.5 gNaCl），涡旋振荡1 min后于7000 r/min速率下离心3 min，取1.0 mL上清液转移至含有50 mg C18和150 mg MgSO4的分散固相萃取管中，涡旋混匀1min后于7000 r/min速率下离心3min，收集上清液与水1:1混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤后，待测定。
1.3 LC-MS/MS分析
液相色谱条件：采用LC-MS/MS进行果蔬中15种植物生长调节剂残留的分析测定。色谱柱为Inertsil ODS-3(75×2.1 mm, 2 μm)，流动相A：5 mmol/L甲酸铵溶液，流动相B：甲醇；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃。梯度洗脱程序见表1。
质谱条件：采用电喷雾离子源，多反应监测模式(MRM)，加热温度450 ℃，喷雾电压：正源5500 V，负源4500 V。每个化合物由两对母离子-子离子对共同确定一个化合物，各化合物的母离子-子离子对及相应的碰撞能量和去簇电压经方法优化后条件见表2，表中标注*子离子为定量离子。
1.4 方法验证和数据分析
通过绘制一系列浓度（0.5、1、 2、5、10、20、50、100、200 μg/L）的基质匹配校准曲线和溶剂匹配校准曲线，每种农药的线性回归方程和相关系数通过对色谱峰面积（y）对浓度（x）进行拟合得到，从而评价农药的线性。根据3倍信噪比所对应的化合物质量浓度以及样品前处理稀释倍数确定检出限（LOD），根据欧盟文件SANTE/11312/2021规定，定量限(LOQ)为试验中回收率满足需求的最低添加浓度（回收率在70-120 %之间，相对标准偏差小于20 %）；采用空白样品添加回收实验评价分析方法的提取效率和准确度。回收实验是在空白样品中添加不同浓度水平的标准溶液，提取前放置1 h让农药浸透基质，每个添加浓度水平设置3个平行，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD）。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
根据有关的文献，大部分植物生长调节剂都易溶于乙腈、甲醇等极性溶剂，考虑到目标化合物的特性，本试验选取了四种不同浓度的乙腈提取剂（分别为含0%、1 %、2 %、3%乙酸）对15种植物生长调节剂的提取效果进行比较。为了避免净化材料的影响，采用只添加提取剂，做四种溶剂下的添加回收试验，确定最佳的提取溶剂。结果见图1，结果表明，在四种提取溶剂中除脱落酸和赤霉酸外，其余13种调节剂回收率都大于70 %。脱落酸在四种提取剂中提取效率都不高，赤霉酸在纯乙腈提取液中的回收偏低，1 %乙酸乙腈回收率可满足回收率条件。因此，选择1 %乙酸乙腈作为本实验的提取溶剂。
2.2 净化条件的优化
考虑到果蔬中有大量的色素、果糖和有机酸，因此选择使用N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化炭黑(GCB)作为吸附剂材料。PSA呈弱碱性，通过极性相互作用及弱阴离子交换作用来净化样品，对于吸附样品中的有机酸、脂肪酸和糖等干扰物有较好的效果，C18能有效吸附弱极性脂肪酸、烯烃类及甾醇类、色素等大分子基质干扰物，GCB对吸附叶绿素、类胡萝卜素等色素以及固醇类杂质有显著的效果，但对具有苯环官能团结构的化合物有也具有强吸附作用[17, 18]。
实验对比了PSA+MgSO4、C18+MgSO4、GCB+MgSO4、PSA+C18+MgSO4、GCB+C18+MgSO4和PSA+C18+GCB+MgSO4的净化效果，结果见图2。结果表明使用PSA作为净化吸附剂时，酸类化合物回收率偏低，如吲哚乙酸、脱落酸、赤霉酸、2, 3, 5-三碘苯甲酸和调果酸，这可能是由于PSA本身具有吸附有机酸的效果，将目标酸性化合物吸附，造成回收率偏低。由图2还可以看出，有GCB作为吸附剂时，噻苯隆、氯吡脲、6-苄基腺嘌呤和2, 3, 5-三碘苯甲酸回收率偏低，这可能是由于这些参数具有苯环官能团，GCB对其有吸附作用，造成这些农药参数回收率偏低。在C18+MgSO4作为净化剂时，除甲基嘧啶磷和2, 3, 5-三碘苯甲酸外，其余农药参数满足回收率要求，且RSD相对较好，因此，选择C18为净化吸附剂。对不同C18用量进行优化（25 mg C18+150 mg MgSO4、50 mg C18+150 mg MgSO4、75 mg C18+150 mg MgSO4、和100 mg C18+150 mg MgSO4）。从图3中可以看出，使用25mg C18+150mg MgSO4时，2, 3, 5-三碘苯甲酸和调果酸回收率高于120 %，且吲哚乙酸和2, 3, 5-三碘苯甲酸RSD大于20 %，当使用50 mg C18+150 mg MgSO4、75 mg C18+150 mg MgSO4、100 mg C18+150 mg MgSO4得到的回收率较好，且当使用50 mg C18+150 mg MgSO4时，农药参数回收率更接近100 %，因此选取了50 mg C18+150 mg MgSO4作为本实验的净化材料。
2.3 方法验证
2.3.1 线性、灵敏度
配制溶剂标准曲线及葡萄基质标准曲线，其浓度梯度为：0.5、1、 2、5、10、20、50、100、200 μg/L，经LC-MS/MS分析后，以色谱峰面积(y)对分析物质量浓度(x, μg/L)进行线性拟合，得出线性回归方程和相关系数，结果见表3。除氯苯胺灵和2, 3, 5-三碘苯甲酸外，其余13种植物生长调节剂在0.5-200 μg/L范围内具有良好的线性关系（r2>0.98），检出限(LOD)为化合物3倍信噪比所对应的浓度，LODs<4.6 μg/kg(详见表3)。本实验的最低添加浓度水平为10 μg/kg，15种植物生长调节剂的回收率均在72.3 %~94.6 %范围内，RSD≤9.3%，故本方法中15种植物生长调节剂的LOQ为10 μg/kg。
1) 溶剂标准曲线
2) 基质标准曲线
1 The calibration curve for each pesticide represents the standard calibration curve in solvent.
2) The calibration curve for each pesticide represents the standard calibration curve in sample.
选取苹果、番茄、草莓、黄瓜、茭白空白基质进行添加回收试验，并考察方法的线性、灵敏度，结果见表S1和S2。在5种基质中，除氯苯胺灵和2, 3, 5-三碘苯甲酸外，其余13种植物生长调节剂在0.5-200 μg/L范围内具有良好的线性关系（r2>0.97），检出限(LOD)为化合物3倍信噪比所对应的浓度，LODs<6.46 μg/kg(详见表3)。本实验的最低添加浓度水平为10 μg/kg，15种植物生长调节剂的回收率均在71.3 %~116 %范围内，RSD≤16 %，故在5种基质中，15种植物生长调节剂的LOQ为10 μg/kg。
2.3.2 基质效应评价
通过计算基质标和溶剂标标准曲线的线性斜率比来评价基质效应(斜率比=基质标线性方程斜率/溶剂标线性方程斜率)。当斜率比为1时，表明没有基质效应存在；当斜率比< 1时，表明存在基质抑制效应；当斜率比> 1时，表明存在基质增强效应。当斜率比介于 0.8～1.2时，基质干扰程度较弱；当0.5＜斜率比＜0.8或1.2＜斜率比＜1.5时，表现为中等程度的基质干扰效应；当斜率比＜0.5或斜率比＞1.5，表示基质效应的干扰强烈[19]。由表4可知，氯吡脲在茭白基质中呈强基质抑制效应，2，3，5-三碘苯甲酸在番茄中呈强基质增强效应，其余植物生长调节剂在黄瓜、草莓、番茄、茭白、苹果、葡萄中的基质效应表现为中、弱基质效应。而为了兼顾所有农药并实现准确定量，仍采用基质标准曲线进行校正。
表4 15种植物生长调节剂的在6种基质中的基质效应
2.3.3 添加回收及精密度
使用空白葡萄、苹果、番茄、草莓、黄瓜、茭白基质进行添加回收实验，添加水平为10、50、200 μg/kg（每个添加水平三次平行），按照优化的方法进行实验，结果详见表3、表S1和表S2。在不同添加水平下，15种植物生长调节剂的平均回收率为71.3 %~116 % ，RSD小于16 %；在6种水果蔬菜基质中，本研究所建立的方法在准确度和精密度方面均符合残留分析要求。
3 总结与讨论
本研究建立了果蔬中中15种生长调节剂残留的简便、快速和精准分析方法。以葡萄为代表性样品展开系统方法优化，通过研究QuEChERS过程中提取液和不同吸附剂对目标农药回收率的影响，筛选出C18作为净化吸附剂，并优化其用量，结合LC-MS/MS对目标生长调节剂进行检测。方法验证结果表明，15种生长调节剂线性范围内线性良好，准确度和精密度高。由于存在基质效应，本方法需要基质匹配标准溶液进行定量。本方法对苹果、番茄、草莓、黄瓜、茭白基质均展现出良好适用性。因此，本方法可为果蔬中15中植物生长调节剂快速检测提供新的方法依据。为我国农产品质量安全监管工作提供技术支撑。