种质资源收集与评价岗位

姜建福 樊秀彩 张颖 孙磊 刘崇怀

  葡萄童期较长，无核表型仅能在成年结果植株中进行筛选，造成无核葡萄新品种选育进程缓慢。DNA标记技术的发展，为植物育种提供了新的方向，通过标记辅助选择（Marker assisted-selection，MAS）可以实现对目标性状在幼苗期的鉴定，缩短育种周期。因此，筛选准确高效的葡萄无核分子标记对育种工作有重要意义。目前国内外基于葡萄无核主要位点SDI（Seed Development Inhibitor，种子发育抑制）开发了一系列无核分子标记，主要包括序列特征扩增区（Sequence Characterized Amplified Region, SCAR）和简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）两种标记。本试验基于国内外研究的基础上，对已报道的3个SCAR标记和6个SSR标记进行通用性验证，以期从中筛选出适用于自然群体的葡萄无核分子标记，为加快无核葡萄新品种的选育提供技术参考。以88个无核种质和120个有核种质组成的自然群体为试材，对国内外已发表的9个常用葡萄无核分子标记进行通用性验证。

  1 材料与方法

  试验于2022-2023年在中国农业科学院郑州果树研究所进行。试验共包含208份种质，包含无核种质88份和有核种质120份，试验所用材料均保存于国家葡萄种质资源圃（郑州）。

  取葡萄健康幼嫩叶片，提取DNA，选用9个已报道的与葡萄无核表型相关的分子标记（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，含FAM荧光探针的SSR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。反应体系和PCR扩增以及产物检测参考相关文献进行，统计分析相关引物的真阳性（True Positive，TP）、真阴性（True Negative，TN）、假阳性（False Positive，FP）、假阴性（False Negative，FN）、准确率（Accuracy）和无核检测率（Nuclear-free Detection Rate，NDR）。

  2 结果与分析

  2.1 SCAR标记验证及不同标记间准确率比较

  在208个葡萄品种中验证SCAR类型无核标记的通用性。结果如表1所示，标记GSLP1-569在葡萄品种间的鉴定准确率和无核检测率分别是57.12%和90.51%。检测到的16个品种包含14个无核品种和2个有核品种，其中11无核品种是‘无核白’及其衍生后代，可见GSLP1-569适合针对无核白及其后代的检测。标记SCC8-1080分别在53个无核品种和19个有核品种中扩增出1080 bp的特异性条带，经统计在208个葡萄品种间的鉴定准确率和无核检测率分别是72.20%和79.18%；标记SCF27-2000分别在87个无核品种和55个有核品种中扩增出2000 bp的特异性条带，在208个品种间的鉴定准确率和无核检测率分别是75.38%和67.82%。3个SCAR类型标记中SCF27-2000的准确率和真阳性最高；标记GSLP1-569有较高的无核检测率、假阴性和真阴性。鉴定结果表明，在针对自然群体的检测中SCF27-2000综合表现最优，适用于无核葡萄新品种的SCAR分子辅助选择。

  2.2 SSR标记检测标记位点及基因型分析

  对6个SSR无核标记的通用性进行了验证，结果表明：6个标记分别检测到3-24个不等的标记位点，这些位点大小在101bp-321bp之间，标记p2-VvAGL11检测到的位点最少，5U_VviAGL11检测到的位点最多。每个标记表现最好的标记位点如表2所示，经卡方检验与种子有无均极显著相关，检测出这些位点的种质中无核种质占41.4%-89.4%，p1-VvAGL11的250bp占比最高，同时在41.7%的三倍体种质中检测到该位点。这些位点在56.1%-88.1%的无核葡萄种质中检测到，5U_VviAGL11的315bp占比最高，在三倍体种质中未检测到该位点。

  6个标记分别检测到5-75种数量不等的基因型，标记p2-VvAGL11检测到的基因型数量最少，5U_VviAGL11检测到的数量最多。每个标记表现最好的基因型如表3所示，经卡方检验与葡萄种子有无极显著相关。检测到这6种基因型的种质中，71%-93.3%的种质为无核表型，标记5U_VviAGL11检测到的种质中无核种质占比最高；无核种质中24.4%-86.7%的种质检测出这6种基因型，其中p1-VvAGL11检测到的250/250在无核种质中占比最高；有核种质中仅有1.7%-24.2%检测到这6种基因型；5U_VviAGL11检测到的307/315在有核种质中占比最低。

  2.3 SSR标记验证及不同标记间准确率比较

  对6个SSR类型无核标记进行验证。结果（表4）显示p1-VvAGL11准确率最高，达到88.47%， 无核检测率为87.74%。p3-VvAGL11和5U_VviAGL11的无核检测率较高，分别为90.72%和90.80%，同时二者的真阴性也最高，分别为95.00%和95.83%。p1-VvAGL11真阳性最高，为89.44%；6个标记假阳性值均表现良好，最高是VVSD10，为32.92%，最低是p3-VvAGL11，仅为5.00%。整体上p1-VvAGL11综合表现最优，适用于无核葡萄新品种的SSR分子辅助选择。

  3 结论

  SCAR标记SCF27-2000和SSR标记p1-VvAGL11准确率高，综合表现最优，适用于无核葡萄新品种的分子辅助选择。