蓝靛果哈尔滨综合试验站

霍俊伟 李斌

  蓝靛果(Lonicera Caerulea L.)学名蓝果忍冬，俗称羊奶子、山茄子等，果实中含VB1、VB2、Vpp等多种维生素，还含有丰富的黄酮类多酚、花青素、维生素C、芸香甙等抗氧化成分。目前抗氧化成分较常用的提取方法是溶剂浸取法，此外还有微生物破壁法、CO2 超临界萃取、酶解提取法、超声波提取法、微波提取法等。但由于花色苷稳定性较差，易受pH、温度、金属离子、光照等因素的影响，提取的抗氧化成分活性不高，这很大程度上限制了它保健功能的发挥与产品应用。超高压技术是将液体或气体加压到100Mpa以上的技术，具有冷杀菌与增加有效成分提取率的作用。目前超高压技术在食品、制药研究等很多领域都有应用，既可以减少高温对提取物质的影响，也可以提高产品的质量和产量。岳晓霞、李斌等对蓝靛果色素和多酚的提取和抗氧化作用已做了相关研究，但关于超高压处理对蓝靛果总抗氧化物的影响的研究未见报道。本试验利用UHP技术研究了超高压处理对蓝靛果总抗氧化物的提取率和抗氧化活性的影响，并通过电镜观察超高压处理对蓝靛果细胞的影响，从微观角度解释了超高压处理可以提高抗氧化物提取率的原因，为蓝靛果抗氧化物的开发和深加工提供技术参考。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  新鲜蓝靛果。

  1.2 试验方法

  1.2.1 超高压提取抗氧化物

  将新鲜蓝靛果果实打浆后每30g为一个样品，以液料比 10:1加入酸化丙酮（0.1% HCL，60%丙酮水溶液）于PET瓶中，将样品分别置于0 MPa(对照)、100MPa、200MPa、300 MPa、400MPa、500MPa、600MPa条件下处理15min后，在离心机中4000r/min离心15min取上清液旋转蒸发浓缩后，真空冷冻干燥收集粉末作为样品备用。

  1.2.1.1 粗提取率计算

  1.2.1.2 多酚含量测定

  采用福林-酚法进行测定，将上1.2.1中的粉末配置成1 mg/mL水溶液，取样品1mL，加入福林试剂2mL，混匀，在0.5～8 min内加入3 mL 7.5%的Na2CO3溶液，充分混合，30℃避光放置2h后，测在波长765 nm处的吸光度。以没食子酸为标样，制作标准曲线，所得标准曲线方程为：y=0.08101+5.01139x（R2=0.9998）。没食子酸在0.005～0.05 mg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，根据标准曲线方程求出提取液中多酚质量浓度(mg/mL)。

  总酚含量按式(2)计算：

  式中：X为冻干粉样品中总酚的含量/（μg/mg）（蓝靛果多酚相对没食子酸的微克数）/（μg/mg）；ρ为根据标准曲线方程计算出待测液中多酚的质量浓度/（mg/mL）；V为待测液体积/mL；N为稀释倍数；m为冻干粉样品质量/mg；1000为mg转化为μg的因子。

  1.2.1.3 花色苷含量的测定

  本试验采用pH示差法测定花色苷含量。将 1.2.1中的粉末配置成1mg/mL水溶液，取同一样品各1mL，分别加入 pH值为1.0、4.5的缓冲溶液9mL，室温下平衡20min后，以蒸馏水为空白，于510nm和700nm波长下测定其吸光度，计算花色苷含量。稀释后样品的吸光度 ΔＡ按下式计算：

 

  (A=A 510－A )pH1.0700－(A 510－A pH4.5700 ) (3)

  花色苷含量按下式计算：

  式中：ΔＡ为吸光度；Mw为矢车菊3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF为样品的稀释倍数（初始稀释倍数×缓冲液的稀释倍数）；ε为矢车菊3-葡萄糖苷的摩尔消光系数， 26900mol-1；V为加入样品体积；m为加入冻干粉的质量； 1000是将g转化为mg的因子；L为比色皿光程（一般为1cm）。

  1.2.1.4 抗坏血酸(VC)含量的测定

  采用2,4-二硝基苯肼法，原理为样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，可利用比色法测定，根据标准曲线计算出待测样品的Vc含量。

  1.2.2 抗氧化能力测定

  1.2.2.1 ABTS+•自由基清除能力测定

  总抗氧化能力检测，取1.2.1待测样品粉末配置成浓度为1 mg/mL的PBS溶液。取96孔板，在每个检测孔中加入 200μL ABTS工作液后将10μL待测液放入检测孔中，轻轻混匀。室温孵育 2～6 min 后测定其在734nm处吸光度，根据标准曲线计算出待测样品的ABTS+•自由基清除能力。

  1.2.2.2 FRAP自由基清除能力测定

  FRAP自由基清除能力测定，取1.2.1待测样品粉末配置成浓度为1 mg/mL的PBS溶液。取96孔板，在每个检测孔中加入180 μL FRAP工作液。后将5μL待测液放入检测孔中，轻轻混匀。37℃孵育 2～6 min 后测定其在 593 nm 处吸光度，根据标准曲线计算出待测样品的 FRAP 自由基清除能力。

  1.2.2.3 总抗氧化能力DPPH自由基清除能力测定

  将1.2.1中的粉末配置成1mg/mL水溶液作为待测液，参照吕春茂等人的方法略作改动，配制0.2mmol/LDPPH乙醇溶液，放在避光低温条件下保存，在试管中加入2mLDPPH乙醇溶液及2 mL样品溶液，在室温避光放置30min，于517 nm波长下用无水乙醇调零，并测定吸光值 A1；将DPPH乙醇溶液用等体积的无水乙醇代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等体积无水乙醇溶液代替，其他操作相同，测定吸光值 A0，DPPH自由基清除能力按公式（5）计算。

  1.2.3 细胞微观结构的观察

  本试验制片方法采用超薄切片技术，将未处理和在超高压400MPa处理后的蓝靛果用刀片切成1mm3组织小块，经过固定、脱水、包埋、固化、超薄切片、染色制成电子透射镜切片备用。将切片放在电镜下观察，首先在放大1000倍下观察各组处理后蓝靛果细胞的整体形态评估其受超高压处理之后的破坏程度，其次在放大3000倍下观察蓝靛果组织细胞细胞壁在超高压处理后的松散程度以及细胞内容物存在状态。

  1.3 数据处理与统计分析

  所有试验重复3次，采用 Excel2007软件对试验数据进行整理绘图，用 SPSS18.0软件对数据进行方差分析，并进行Duncans’差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

  2 结果与分析

  2.1 超高压处理对提取率的影响

  表1为不同压力下蓝靛果总抗氧化物的提取率。由表1 得出经过100~600MPa超高压处理样品中抗氧化成分的提取率，明显高于对照组(P＜0.01)，达到差异极显著水平，且提取率随着压力升高呈现先升高后下降的趋势，在提取压力为300MPa时提取率最大达到85.2 mg/g，而对照仅为78.4 mg/g。说明超高压处理具有提高蓝靛果总抗氧化物提取率的作用。

  2.2 冻干粉中多酚含量

  据Xi J等研究报道，超高压提取可以提高茶多酚的提取率及其抗氧化活性。图1为不同压力下冻干粉样品中多酚含量，可以看出样品中多酚的提取率随着压力的升高先增大后减小，当压力为300MPa时提取率最大为136.48μg/mg，且各组多酚含量差异显著P＜0.05。100MPa与对照组相比多酚含量较低，说明在100MPa环境下蓝靛果多酚不稳定。一般来说压力越大植物细胞受到压力的破坏作用越大，越有利于植物多酚物质的提取，但试验中提取压力高于300 MPa时多酚含量下降，造成这种现象的原因可能为压力过高使蓝靛果中蛋白质分子结构改变，位于分子折叠结构中易于接近的反应位点得到充分暴露并与小分子多酚结合从而降低了多酚的含量。

  2.3 冻干粉中花色苷含量

  图2为压力对冻干粉样品中花色苷含量影响。图中花色苷含量随着压力的上高先增大后减小，400MPa时花色苷含量明显高于其他5组试验样品且差异显著P＜0.05，含量达 4.12μg/mg。对照组、100MPa组花色苷含量差异不显著P＞0.05说明压力小于100MPa对促进花色苷的提取作用不大。与对照组相比600MPa压力条件下花色苷含量较少且差异显著P＜0.05。研究表明蛋白质、淀粉等生物大分子对花色苷具有一定包埋作用，压力达到600MPa蓝靛果中蛋白质、淀粉结构发生改变，这种变化很可能促进包埋反应导致花色苷在离心过程中损失，最终导致冻干粉中含量下降。

  2.4 冻干粉中抗坏血酸含量

  试验测定抗坏血酸含量如图3所示，经过计算得出在1~12μg/mL浓度范围内的线性回归方程：A=0.0231C+0.0640（R2=0.9989），式中C为VC浓度，A为吸光度。经过比较冻干粉样品中对照组Vc含量最高为27.14 μg/mg；100MPa、200MPa、500MPa三组VC含量差异不显著P＞0.05。表明超高压处理会对蓝靛果VC会造成一定损失。VC、多酚、花色苷均为小分子物质，且都有抗氧化活性易与生物大大分子结合，推测造成图3现象的原因与多酚、花色苷损失相同都是由于蛋白质，淀粉等生物大分子对小分子的包埋作用造成的损失，且生物大分子对VC的包埋易受压力的影响。

  2.5 抗氧化活性的变化

  2.5.1ABTS+•自由基清除能力

  图4表示了不同处理样品的清除ABTS+•自由基的能力，计算得出标准品在0.15~1.2mM范围线性回归方程A =-0.6029X+0.6673，R² =0.9994。式中X为标准品当量浓度，A为吸光度。图中得出超高压辅助提取抗氧化物清除 ABTS+•自由基能力以400MPa(0.37mM)为分界点先增大后降低，且都要比对照组高，各组清除ABTS+•自由基能力差异显著P＜0.05。说明超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物清除ABTS+•自由基能力的作用。

  2.5.2FRAP 自由基清除能力

  图5为各组样品的Fe3+还原能力，计算得出标准品在0.15~1.2 mM 线性回归方程：A = 0.0437X+0.016，R² = 0.9945式中X为标准品当量浓度，A为吸光度。与清除ABTS+•自由基能力具有相同的趋势，超高压辅助提取抗氧化物 Fe3+还原能力以400MPa(0.84 mM)为分界点先增大后降低，且都比对照组高，各组Fe3+还原能力差异显著P＜0.05。说明超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物 Fe3+还原能力的作用。

  2.5.3 DPPH自由基清除能力

  图6为各组清除DPPH自由基能力，并不像ABTS+•自由基清除能力和 Fe3+还原能力具有一定规律，清除率高低次序为：400MPa＞600MPa＞对照组＞100MPa＞300MPa＞200MPa＞500MPa，其中400 MPa(91.5%)、600MPa(88.4%)的抗氧化物提取溶液对DPPH自由基清除率均高于对照组，其他提取条件下的结果则低于对照组，各组试验结果差异显著P＜0.05。说明在400MPa，600MPa条件下超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物DPPH自由基清除率的作用。

  2.6 微观结构的观察

  通过电子透射镜观察超高压处理对蓝靛果细胞结构的影响，探究超高压处理提高蓝靛果抗氧化物提取率的原因。根据试验测定抗氧化活性，得出400MPa超高压条件下提取蓝靛果物抗氧化活性总体最高，所以选取400MPa为试验组，分别在放大1000倍和3000倍下观察蓝靛果细胞结构。图7a、图7b分别为对照组，试验组在放大1000倍条件下观察细胞整体结构，图7c、图7d 分别为是对照组，试验组在 3000倍条件下观察细胞壁的结果。

  通过对比图7a、图7b可以看出，在放大1000倍条件下观察未经过处理的蓝靛果细胞结构完整，细胞壁轮廓清晰，细胞内容物没有溢出，试验组细胞结构遭到破坏，细胞壁轮廓混乱，内容物溢出。对比图 7c、图7d可以看出对照组样品细胞壁结构紧实、纹路规整、连接紧凑，试验组样品细胞壁结构松散、纹路模糊、连接断裂。结果说明超高压处理可以破坏蓝靛果细胞和细胞壁结构使细胞内抗氧化物与溶剂充分接触，从而提高抗氧化物的提取率。

  3 结论

  通过试验结果分析得出：在提取时间为15min，辅助提取压力在300 MPa时抗氧化物粗提取率最高为85.2 mg/g；抗氧化物冻干粉中总酚、花色苷、VC含量分别在300MPa、400MPa和对照组中达最大，分别为136.48μg/mg、4.12μg/mg和27.14μg/mg；抗氧化活性检测结果表明大多数经过超高压处理的试验组抗氧化活性要比没有经过处理的对照组高，在超高压为400MPa时ABTS+•、FRAP、DPPH自由基清除能力均达到最大值分别为0.37mM、0.84mM和91.5%，利用 SPSS18.0软件对数据分析发现试验结果中大部分数据组差异显著，这说明超高压处理对蓝靛果中三种抗氧化物提取率及总抗氧化活性具有显著影响。

  通过电镜制片观察发现，蓝靛果细胞结构受超高压影响巨大，未经过处理的蓝靛果细胞结构完整，细胞壁轮廓清晰、结构紧实、纹路规整、连接紧凑，细胞内容物没有溢出；经过超高压400 MPa处理的试验组样品细胞结构遭到破坏，细胞壁轮廓混乱、结构松散、纹路模糊、连接断裂，内容物溢出。这说明超高压处理使蓝靛果细胞破碎，使得溶剂与抗氧化物可以充分接触，进一步从微观角度解释了超高压处理提高抗氧化物提取率的原因。