树体病害防控岗位
1 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）
PCR技术利用特异性引物、dNTP和热稳定性Taq DNA聚合酶以及温控来实现目标DNA片段在体外的短时迅速扩增，自1985年由Kary Mullis提出以来便迅速发展不断成熟，被广泛应用于植物病原真菌的鉴定与检测。PCR技术相比于传统生物学鉴定具有一些优势：不需要纯培养物，可以在复杂混合物中检测到目标分子，同时具有特异性强、灵敏度高、节省时间等特点。但也存在一定局限性：需要依靠琼脂糖凝胶电泳来进行PCR反应产物的鉴定，不能定量分析；在检测植物组织的病原真菌时，常常会因模板核酸含量低或样品不纯而产生假阴性的结果。为解决PCR的问题，以常规PCR为基础的其他快速检测技术逐渐发展起来，如多重PCR、巢式PCR、实时荧光PCR、数字PCR等。
2 多重PCR（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）
多重PCR是以常规PCR为基础，通过将两对及以上的特异性引物添加到同一反应系统中，引物与相应的特异互补模板结合进行扩增，根据产物片段长度的不同确定病原真菌种类。如代玥等人2021年建立了镰孢菌的多重PCR反应检测体系，通过扩增片段的大小区分锐顶镰孢菌（F. acuminatum）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄病镰孢菌（F. solani）和禾谷镰孢菌（F. graminearum），基因组DNA最低检测浓度为1×10-4 ng/μL。多重PCR技术能够灵敏、特异的同时检测出该四种镰孢菌，并及时明确大豆根腐病镰孢菌复合侵染的情况。多重PCR在保证反应特异性的同时，又具备省时、低成本的优点，但也会出现引物竞争靶标序列、体系中引物过多增加检测假阳性概率等问题。
3 巢式PCR（Nested PCR）
巢式PCR共有两对引物，外引物一般为常用引物，内引物为特异性引物。先使用外引物进行第一轮扩增，扩增产物作为第二轮扩增DNA模板，再使用内引物进行第二轮扩增。巢式PCR经过两轮PCR扩增，特异性和灵敏度都有较大的提升。马红霞等人2023年同时建立了玉米叶片内的多堆柄锈菌（Puccinia polysora）PCR检测和巢式PCR检测，发现巢式PCR检测体系灵敏度是常规PCR的500倍，可用于潜伏期多堆柄锈菌的检测。二者同样检测1 g玉米叶片中含的多堆柄锈菌夏孢子、夏孢子堆和侵染点，巢式PCR阳性样本检出率明显高于普通PCR，且都有检测到阳性样品。因此，当植物体内病原真菌含量低或分布不均匀时，使用巢式PCR进行检测更加准确。
4 实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR, qPCR）
qPCR技术1996年由美国Applied Biosystems公司首先推出，是在PCR基础上发展起来的第二代PCR检测技术，该技术的出现使PCR的研究从定性分析跨越到定量分析。qPCR是指在PCR反应体系加入荧光基团，通过实时监测收集扩增过程中荧光信号的变化，通过软件对荧光数据的分析，得出循环阈值并绘制扩增曲线。在曲线的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量存在线性关系，可对起始模板进行定量分析。
qPCR有2种常用荧光物质：SYBR Green Ⅰ荧光染料法和TaqMan荧光探针法。SYBR Green Ⅰ 具有可嵌合到双链DNA小沟的特性，游离状态下荧光较弱，扩增过程中与双链DNA结合后荧光迅速增强。染料法适用于任何DNA，使用简单，成本低，但由于该染料是非特异性地结合在双链DNA上，扩增过程中一旦有非特异性产物或引物二聚体，也会产生荧光信号，导致结果出现假阳性，此种方法一般不适合进行多重qPCR的分析。TaqMan探针是一段5‘端连有荧光报告基团，3’端连有荧光猝灭基团的核苷酸序列。当探针完整时不产生荧光，扩增过程中探针被水解，荧光基团与猝灭基团分离，荧光基团产生荧光。相对于染料法，探针法特异性强，适用于多重qPCR检测，但每个基因都需要进行单独探针的设计与合成，成本较高。
qPCR有2个重要概念：荧光阈值(threshold)和循环阈值（Ct值）。荧光阈值是扩增曲线指数增长期上的一个值，通常是仪器自动设置。Ct值是扩增过程中扩增产物的荧光信号达到荧光阈值时所经过的扩增循环次数，通常样品的Ct值与起始浓度存在线性关系，起始浓度越高，Ct值越小。此外，qPCR有2种定量方法：绝对定量和相对定量。绝对定量是用已知样品做标准品，进行qPCR反应，分析得到以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线，将未知样品进行qPCR反应得到的Ct值代入曲线进而对未知样品进行定量，一般用于植物病原菌的定量检测、转基因拷贝数分析等。相对定量是以稳定的内参基因作为参照，分别测定目的基因和内参基因的Ct值，再求出对于内参基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较，一般可用于比较某一目的基因，在不同的样本中表达量的差异等。相对于绝对定量，相对定量更加简单快速，但需注意使用相对定量时目的基因和内参基因的扩增效率要趋于一致。
与PCR相比，qPCR可以在扩增过程进行实时监测，直接对待测样品进行定量，不需要进行扩增产物结果查看，提升了检测速度，无需开盖检测，减小污染。qPCR目前已经在多种植物病原真菌定量检测中得到十分广泛地应用。如马铃薯丝核菌病菌(Rhizoctonia solani)、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe aspalathi)、小麦条锈病菌(Puccinia striiformisf. sp. tritici)等病原真菌定量检测。
其次，多重qPCR检测技术也广泛用于植物病原真菌检测中，多重qPCR方法就是在同一个检测体系中对多个目标序列同时进行检测并分别定量，多用探针法进行荧光标记。Yosra Ahmed等人开发了检测柑橘作物的四种主要病原真菌的多重qPCR检测技术，特异性强、重复性好、四种病原真菌最低检出限拷贝数约为200 copies/μL。同时使用多重PCR和多重qPCR对103份柑橘样品进行检测，结果100%一致。多重qPCR的建立不仅有助于诊断症状不明确或潜伏阶段样品中的病原真菌种类，而且还将显著减少检测时间和检测成本。朱桐杉等人建立了可同时检测金银花褐斑病、白粉病及炭疽病3种病害的多重qPCR检测体系，分别使用FAM、JOE和ROX荧光基团进行探针标记。最低检测限度为2.94×102 copies /μL，是普通PCR的100倍。对15例有叶部病害症状的金银花病叶进行检测，可迅速准确检测出每个样品病害类型。需注意多重qPCR在检测体系建立过程中对引物和探针的要求较高，避免二聚体的形成，同时随着检测重数的增多，不同分子模板扩增带来竞争抑制，导致扩增效率下降，影响检测结果。
5 微滴数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)
ddPCR是在qPCR基础上发展起来的一种新型的核酸分子绝对定量技术，被称为“第三代PCR技术”。其主要原理是在PCR扩增前对反应体系进行分区，将单个DNA分子分散到不同的微滴中，实现单分子模板扩增，结束后通过收集终点荧光信号的有无，结合泊松分布统计，确定起始样品中目的基因的拷贝数。与其它分子检测技术相比，ddPCR的主要优势在于：高灵敏度，可以检测到单分子扩增；通过扩增终点荧光信号的采集，计算出靶标序列的拷贝数，实现绝对定量，不需要借助标准品和参考曲线；高稳定性，对PCR反应抑制物耐受能力高，对样品适用性高。最早在医学方面被广泛应用，关于植物病害的检测较少。
2014年，Tanja Dreo等人首次评估了ddPCR在植物病原菌检测方面的可行性，建立了对蔷薇科和茄科两种检疫性病原细菌的ddPCR检测技术。随后ddPCR技术在植物病害检测方面展开应用，Tongshuo Xu等人建立一种快速诊断和定量小麦上Tilletia laevis的ddPCR方法，与SCAR标记和qPCR相比，该技术检测灵敏度最高，检测限为30 fg/μL。Abdelrazig等人基于actin基因设计两对引物用于辣椒炭疽病主要致病因子Colletotrichum truncatumh和C. scovillei的检测，具有较高的敏感性和特异性，ddPCR检测到的最低浓度较普通PCR低数千倍。
多重ddPCR通过体系分隔克服了不同模板分子扩增带来的竞争抑制，可以精准检测出每一种模板分子的含量，同时弥补了ddPCR成本高的缺点。Larrabee等人应用双重ddPCR技术对甜樱桃不同生育期Alternaria spp.和Botrytis cinerea进行定量分析，最低检出限为0.1 pg，结果发现，一般情况下甜樱桃在花瓣衰落期带菌量最低，收获期最高。但使用ddPCR检测方法需要昂贵的仪器设备，检测成本较高，不适用于基层部门。