豫东综合试验站
崔小月 娄玉穗 张柯 尚泓泉 樊红杰 吴文莹 张晓锋 吕中伟
钙一般以Ca2+的形式存在，是植物生长发育过程中一种必需的营养元素。一方面，作为构成植物细胞壁和细胞膜结构的必须物质，Ca2+具有稳定细胞壁、细胞膜和膜结合蛋白的功能；另一方面，Ca2+又可作为一种信号分子响应激素和多种逆境胁迫。Ca2+浓度过高或过低均会影响植物的正常生长，过高的Ca2+浓度引起Ca2+中毒和代谢紊乱，过低的Ca2+浓度则会阻碍植物生长，且极易引发因缺素而产生的并发症，严重影响作物产量和品质。因此，细胞质Ca2+浓度的稳定对于维持细胞功能十分重要，而Ca2+的稳定主要依赖于Ca2+通道、Ca2+-ATPase和Ca2+/H+反向转运蛋白（CAX）等组成的Ca2+转运系统。CAX是一个多基因家族，主要定位在液泡或液泡膜上，拟南芥中有6个AtCAX基因，苹果8个，水稻6个，均分为I A和I B 2个亚家族。目前，对植物CAX基因在抵抗非生物胁迫中功能的研究主要集中在耐寒、耐旱、耐盐和耐渗透胁迫方面。关于植物中CAX基因家族的研究主要包括拟南芥、水稻、苹果和甘蓝型油菜等，在葡萄中尚未见到相关报道。随着葡萄基因组的公布，使得对葡萄CAX基因家族的鉴定和分析成为可能。
1 材料与方法
1.1 欧洲葡萄CAX基因家族成员鉴定
欧洲葡萄全基因组序列、蛋白序列和注释文件从Ensemble Plants下载，CAX基因家族成员的鉴定基于隐马尔可夫模型，通过搜索关键词的方法在Pfam网站得到CAX家族的保守结构域模型（PF01699）并下载其hmm文件，E值设置为<e-6，通过软件TBtools获得潜在的VvCAX序列。经CDD和SMART进行保守结构域分析，得到含有CAX蛋白保守结构域的序列。将获得的序列与拟南芥的6个CAX序列进行比对和进化树分析，采用邻接法、泊松模型、成对删除、Bootstrap重复1000次，最终获得VvCAX的全部成员。
1.2 欧洲葡萄CAX基因家族生物信息学分析
根据葡萄基因组序列，利用TBtools获得葡萄各条染色体的长度，VvCAX家族基因的染色体定位通过MapGene2Chromosome v2呈现，并根据各基因在染色体上的位置依次对其进行命名。利用ExPASy分析葡萄CAX蛋白质的氨基酸数目、分子量、等电点、脂溶指数、总平均疏水指数，TMHMM -2.0用于分析跨膜结构域数目。VvCAX基因家族成员的二级结构、三级结构、亚细胞定位、基因结构和保守基序分别通过NPS@SOPMA secondary structure prediction method、SWISS-MODEL、WoLF PSORT、GSDS 2.0和MEME进行分析。
1.3 多序列比对和系统发育分析
通过ClustalX2对5个VvCAX的氨基酸序列进行比对分析。通过MEGA6软件，用邻接法对已鉴定的欧洲葡萄、拟南芥、甘蓝型油菜、水稻和苹果的CAX家族蛋白进行系统进化树构建，Bootstrap值设置为1000。通过在线软件EvolView将结果进行可视化。
1.4 VvCAX基因的表达模式分析
供试材料‘红地球’葡萄保存于河南现代农业研究开发基地葡萄示范园，成熟叶、幼叶、卷须、花、果、茎用于组织特异性分析。ABA处理下VvCAX基因在‘赤霞珠’葡萄不同组织的表达变化分析基于微阵列数据（GSE78798），机械损伤、紫外线照射和霜霉菌侵染时‘黑比诺’葡萄VvCAX基因的表达变化基于微阵列数据（GSE37743）。长势一致且生长健壮的‘红地球’葡萄叶片用于非生物胁迫处理，将采回的叶片叶柄用湿棉花包裹，置于放有湿滤纸的托盘上，分别对叶片进行4℃、40℃和10% PEG6000处理，并于处理的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h取样，每个处理设置3次生物学重复。
将样品在液氮中研磨，使用E.Z.N.A.® 植物总RNA试剂盒（OMEGA，美国）按照说明书提取RNA。利用诺莱酶公司的反转录试剂盒合成cDNA的第一条链，稀释到浓度为100 ng/μL后用作实时荧光定量PCR的模板。使用Primer3设计基因的特异性qRT-PCR引物，内参基因为VvActin7（Accession no. XM_002282480），各引物序列如表1所示。qRT-PCR的反应体系和程序参照丁兰等人的方法，每个处理设置3个重复，基因相对表达量采用2-ΔΔCT法进行分析，误差线代表3次生物学重复的标准误差（±SE）。显著性分析使用SPSS 23.0，采用图基检验进行单因素方差分析（P <0.05）。
2 结果与分析
2.1 VvCAX基因家族的鉴定和特征分析
根据CAX家族的保守结构域模型（PF01699）的hmm文件，通过软件TBtools获得26条潜在的VvCAX序列，符合E值<e-6且包含Na_Ca_ex结构域的序列有22条。将这22条序列与拟南芥的6个CAX进行系统进化分析发现，22条序列中有5个CAX家族成员（图1A），因此，欧洲葡萄中共存在5个CAX基因。染色体定位分析发现5个CAX基因分布在葡萄的5条染色体上，每条染色体上分布1个VvCAX基因（图1B），根据它们在染色体上的位置，依次命名为VvCAX1−VvCAX5。理化性质分析（表2）显示，VvCAX家族基因编码区长度为1,341−1,566 bp，编码446−521个氨基酸，等电点5.38−7.25，其中VvCAX3为碱性蛋白，其余4个为酸性蛋白。5个VvCAX蛋白均为较为稳定（脂溶指数>90）的疏水性（总平均疏水指数>0）蛋白，且含有10−11个跨膜结构域。VvCAX蛋白的二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲，占比超过80%，主要定位在质膜和液泡上（表3）。对VvCAX进行三级结构分析发现，所有VvCAX蛋白的三级结构非常相似且均为单体（图1C）。
2.2 VvCAX家族的氨基酸序列比对和系统发育分析
经分析发现VvCAX有10−11个跨膜结构域（TM）和4个典型的功能域，分别是N端自抑制区域（NRR）、Ca2+功能域（CaD）、C功能域和D功能域，且在TM3与TM4、TM8与TM9之间包含与转运特异性离子有关的保守氨基酸重复序列c-1和c-2（图2）。对欧洲葡萄VvCAX1−VvCAX5、拟南芥AtCAX1−AtCAX6、甘蓝型油菜BnaCAX1-1−BnaCAX5-3、苹果MdCAX1−MdCAX8和水稻OsCAX1−OsCAX4共42个CAX家族蛋白进行系统进化树分析发现，VvCAX蛋白可分为2个亚家族，分别为亚家族I A和I B。其中，亚家族I A包含2个成员，即VvCAX1和VvCAX2，亚家族I B包含3个成员，即VvCAX3−VvCAX5（图3）。
2.3 VvCAX基因的表达模式分析
分析了4个VvCAX基因在欧洲葡萄品种‘红地球’（Red Globe）不同组织中的相对表达量发现，I A亚家族的VvCAX基因在花中的表达量最高；I B亚家族的VvCAX3和VvCAX5基因主要在葡萄成熟叶和卷须中表达（图4）。对‘赤霞珠’葡萄的浆果、茎尖、叶片、根和悬浮细胞进行10 μM ABA处理2 h后发现，VvCAX1和VvCAX2基因在叶片中的表达量升高，VvCAX3、VvCAX4和VvCAX5基因在叶片中的表达量降低（图5A）。对‘黑比诺’葡萄进行创伤和霜霉菌侵染发现，创伤和霜霉菌处理后，VvCAX1表达水平降低，VvCAX2基因表达水平升高，I B亚家族的VvCAX基因变化不明显；紫外线处理后，I A亚家族的VvCAX基因表达下调，I B亚家族的VvCAX基因表达上调（图5B）。对‘红地球’葡萄叶片进行4℃低温处理发现，短时间（2 h）的低温抑制VvCAX基因的转录，所有VvCAX1基因的转录水平均呈现出“下降-升高-下降”的趋势，其中VvCAX1基因对低温胁迫最敏感，在处理8 h时转录水平达到最大值，约为处理前的3倍（图6A）。4个VvCAX基因对高温（40℃）均有响应，其中VvCAX1和VvCAX5响应最为明显（图6B）。I A亚家族的VvCAX基因比I B亚家族的VvCAX3和VvCAX5基因对PEG6000模拟的干旱胁迫更敏感（图6C）。以上结果表明，位于同一亚家族的VvCAX基因具有相似的表达模式，可能具有相似的生物学功能，所有VvCAX基因均响应ABA，I A亚家族的VvCAX基因可能与创伤、霜霉菌、干旱和低温相关，I B亚家族的VvCAX基因则可能与高温有关。
3 结论
本研究从欧洲葡萄基因组中鉴定出5个CAX基因，与二倍体植物拟南芥、水稻、苹果、森林草莓、丹参和杨树的基因数量相仿，少于四倍体植物甘蓝型油菜基因数量。VvCAX1和VvCAX2属于I A亚家族，VvCAX3、VvCAX4和VvCAX5属于I B亚家族，预示着葡萄CAX基因的功能可能存在分化。VvCAX蛋白均为疏水蛋白，同一亚家族的成员表现出相似的结构特征，如跨膜结构域和内含子数量、二级结构、三级结构、保守基序等，这种现象也出现在拟南芥、水稻和苹果等物种中，表明CAX家族在进化过程中具有保守性。亚细胞定位预测结果显示，VvCAX主要定位在质膜和液泡上。CAX基因家族在不同的组织中表达丰度不同，I A亚家族的VvCAX基因在‘红地球’葡萄花中的表达量最高，I B亚家族的VvCAX3和VvCAX5基因主要在葡萄成熟叶和卷须中表达，暗示了这2个亚家族的VvCAX基因在不同的组织和发育阶段中发挥作用。VvCAX基因上游可能存在一些转录因子，如MYB、dof、ERF等，启动子序列中也包含相应的的顺式作用元件（MYB、dof、ERE），推测VvCAX基因可能响应激素和胁迫反应，经过实时荧光定量PCR验证了这一推论。