蓝莓沈阳综合试验站
在我国，蓝莓种植面积逐年增加，在北方、中部地区、南方均有系统的种植范围。蓝莓的甜度、酸度和香气是由芳香挥发性化合物混合构成的，它们一同组成并影响蓝莓的整体风味。来自不同产区的不同蓝莓品种有着不同的香气特征
综合之前的研究，采用气相色谱-质谱法（GC-MS）对我国3大种植区域的不同品种蓝莓的香气成分进行了基于GC-MS的鉴定和区分，并采用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）对这12个品种蓝莓的主要风味成分进行了分析。GC-MS共检测出619种挥发性成分，包括8种醛类、9种醇类、8种酮类、22种酯类、2种酸类、2种酚类、2种吡嗪类、1种噻吩类、1种苯类和2种呋喃类。其中关键香气成分40种，酯类化合物的比例高达38.6%。主成分分析表明，(E,E)- 2,6 -非二烯醛、γ-癸内酯、β-离子酮和己酸己酯是影响果香的主要成分。
探寻不同种植区域、不同品种蓝莓中挥发性风味物质的异同，有助于我国蓝莓的挥发性成分数据库的建立。有助于为今后通过对果实香气的影响来提高果实品质的育种工作提供数据支持。同时，一个客观、真实的蓝莓果实香气体系将非常有助于蓝莓加工业中选择合适蓝莓品种，有助于消费者根据自身喜好进行选购蓝莓。
1 材料与方法
1.1 蓝莓原料
本研究选用的蓝莓品种来自我国的三大种植区域分别为中部（安徽、浙江），南部（云南、四川、重庆、贵州），北部（辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古），其中蓝莓品种为北方产区（北陆、蓝丰、美登、瑞卡、野生品种），中部产区（莱格西、蓝美1号），南方产区（珠宝、灿烂、杰兔、粉蓝、顶峰、蓝美1号）。所有蓝莓样品均选择没有物理损伤的成熟蓝莓果实。蓝莓果实被带回实验室后，密封在塑封袋里，保存于-80℃冰箱中于24h内进行检测分析。
1.2 试剂与仪器
1.3 GC-MS采集条件
（1）HS-SPME萃取条件：在60°C恒温条件下，震荡5min，120µm DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶，顶空萃取15 min，于250°C下解析5min，然后进行GC-MS分离鉴定。采样前萃取头在Fiber Conditioning Station中250°C下老化5 min。
（2）色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30m × 0.25mm × 0.25μm, Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, USA），载气为高纯氦气，恒流流速1.2 mL/min，进样口温度250°C，不分流进样，溶剂延迟3.5min。程序升温：40°C 保持3.5min，以10°C/min升至100°C，再以7°C/min升至180°C，最后以25°C/min升至280°C，保持5 min。
（3）质谱条件：电子轰击离子源（EI），离子源温度230°C，四级杆温度150°C，质谱接口温度280°C，电子能量70 eV，扫描方式为选择离子检测模式（SIM），定性定量离子精准扫描（GB 23200.8-2016）。
1.4 主成分分析
主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一种无监督模式识别的多维数据统计分析方法，通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。可以在最大程度保留原始信息的基础上将高维复杂的数据进行“简化和降维”，建立可靠的数学模型对研究对象的代谢谱特点进行归纳和总结。
用R软件（www.r-project.org/）的内置统计prcomp函数，设置prcomp函数参数scale=True，表示对数据进行UV（unit variance scaling）处理。
1.5 正交偏最小二乘法判别分析
正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和PLS-DA方法，能够将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理。其中X为样本定量信息矩阵，Y为样本分组信息矩阵。然后利用R软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函数进行分析
2. 结果与分析
2.1 12个品种蓝莓的挥发性成分
基于Metware数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。用MassHunter定量软件打开样本下机质谱文件，进行积分和校正工作，共在不同蓝莓品种中检测到619个挥发性代谢物，主要包括萜类物质（16.64%）、酯类（15.99%）、杂环芳烃（14.7%）、醇类（7.92%）、醛类（6.95%）、酸类（2.42%）等。
其中2-己酰基呋喃、2,6-二甲基-5-庚烯醛、甲酸异莰酯、1-（1H-吡唑-4-基）-乙酮、呋喃酮、4,5-二甲基-1,3-苯二醇、2,6,6-三甲基-2,4-环庚二烯-1-酮、8,8-二甲基-9-亚甲基-1,5-环癸二烯、（5-溴戊基）-苯、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-环己酮、3-甲基硫羟丁酸-S-(1-甲基丙基)酯、5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮、（Z）-戊-2-烯丁酸丁酯、2,4-二甲基-1-（1-甲基乙烯基）-环己烯和姜烯是蓝莓中含量最高的15种挥发性物质，是蓝莓中关键的香气成分，它们大部分为杂环化合物、酯类、萜类和烃类，赋予了蓝莓香甜、清新的香气。
2.2 PCA分析结果
三个对比组的PC1和PC2的累积方差贡献率均超过50%的可信值，因此PC1和PC2足以反映不同蓝莓品种样本之间的差异。在PCA图中，样本间距离近表示差异小，距离远表示差异显著。由PCA得分图可以初步看出我国北方、中部和南方的蓝莓品种中挥发性风味物质的含量不同，部分物质存在显著差异。其中我国北方和中部地区的蓝莓距离较近，说明它们的挥发性成分和风味相似。而中部和南方蓝莓的离散性最强，说明它们的挥发性物质和风味差异较大。
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2.3 OPLS-DA分析结果
为了减少模型开发过程中的过度拟合，采用OPLS-DA进行分组间交叉验证，进行地理区域区分。不同地理区域的蓝莓样品的OPLS-DA得分图和模型验证图分别如图6-11所示。
根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，绘制各分组的得分图，进一步展示各个分组之间的差异，图中横坐标表示预测主成分，横坐标方向可以看出组间的差距；纵坐标表示正交主成分，纵坐标方向可以看出组内的差距；百分比表示该成分对数据集的解释率。图中的每个点表示一个样品，同一个组的样品使用同一种颜色表示，Group为分组。由每组OPLS-DA得分图可以看出组间差异。
在OPLS-DA模型验证图中，预测参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这三个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2 > 0.5时可认为是有效的模型，Q2 > 0.9时为出色的模型。OPLS-DA模型的R2Y和Q2Y值均可接受，且一般情况下，p<0.05时模型最佳。结果表明，不同地理区域的不同品种蓝莓样品可以明显区分，且模型良好。
基于OPLS-DA分析得到的变量重要性投影（VIP＞1）、差异倍数值（log2Fold change＞4）、p＜0.01，在中部和北方蓝莓中筛选出三甲基吡嗪、桉叶油醇、5-乙烯基-4-甲基-噻唑、2-甲基-3-（1-甲基乙基）-环戊酮、3,5-二甲基环己醇、2,3,4,5-四氢-6-丙基-吡啶和α-衣兰油烯为最主要的差异物质，它们均为在北方蓝莓品种中含量显著高于中部地区蓝莓，这几种物质主要的香气为木质、坚果香。
在中部和南方蓝莓中筛选出水杨酸乙酯、三甲基吡嗪、2-甲基-2-丁酸、苯甲酸乙酯、3-甲基苯甲醛、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、2-丁醇-2,3-二甲基乙酸酯、2-甲基-苯甲醛、1-苯基-1,2-丙二酮、4-甲基-1-（1-甲基乙烯基）-环己烯为最主要的差异物质，它们均为在南方蓝莓品种中含量显著高于中部地区蓝莓，这几种物质主要的香气为甜果香、木质、坚果香。
（2R-顺式）-1,2,3,4,4a，5,6,7-八氢-α.α.4a，8-四甲基-2-萘甲醇、2-异丙基-5-甲基-9-亚甲基-双环[4.4.0]癸-1-烯、α-衣兰油烯、beta-杜松烯、(Z)-3-己烯醛和3-甲氧基-5-甲基苯酚为在北方蓝莓中显著高于南方蓝莓的物质，它们主要赋予蓝莓清新的果香；而2-丁醇-2,3-二甲基乙酸酯、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、4-甲基-苯乙醛、水杨酸乙酯、苯甲酸乙酯和（E）-α-佛手柑则是南方蓝莓显著高于北方蓝莓，它们主要赋予蓝莓清新、花果香味以及焦糖味。
其中，含糖类物质的优势品种为蓝丰、北陆和野生蓝莓；酸类物质的优势品种为美登、杰兔和蓝丰。蓝丰具有良好的糖酸比，可用于蓝莓产品的加工或鲜食，具有良好的滋味和口感。
以上对不同种植区域、不同品种蓝莓中挥发性风味物质异同的检测和分析，有助于我国蓝莓的挥发性成分数据库的建立。一个客观、真实的蓝莓果实香气体系将非常有助于蓝莓加工业中选择合适蓝莓品种，同时有助于消费者根据自身喜好进行选购蓝莓。