酿酒微生物

  1 微生物群落结构及其与风味物质的关联

  葡萄酒、普洱茶、食醋、咖啡豆和奶酪等（Wolfe et al., 2014; Illeghems et al., 2015）主要是通过发酵形成，这些发酵是由复杂的微生物群落驱动的，因此，食物微生物群（尤其是尚未培养的微生物）的形成和功能越来越具有吸引力。

  许多依赖或不依赖培养微生物的方法，如肠杆菌基因间重复共有序列（ERIC）-PCR、克隆文库和变性梯度凝胶电泳（DGGE），已被用于鉴定食醋中微生物群落的多样性（Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011a; Nie et al., 2015）。葡萄园和葡萄微生物区系的多样性很久以前就通过传统的微生物技术进行了研究，包括琼脂平板培养、显微镜和生化表征，主要集中在识别与葡萄酒腐败有关的病原微生物。然而，这些技术无法识别不可培养的微生物，这些微生物占葡萄酒微生物相当大的比例（Curtis et al., 2002）。目前，基于测序的新工具正在推动食品微生物学的不依赖培养微生物的研究（Illeghems et al., 2015; Cocolin and Ercolini, 2015; Bagheri et al.,2017）。

  Wu et al.（2015）利用元基因组学鉴定出了醋中的泉古菌（Crenarchaeota）和古广菌门（Euryarchaeota），揭示了微生物群落的多样性和复杂性。但是，这种方法通常无法定义或验证复杂的微生物群中各个菌种的特定作用。在中欧两种自发酵葡萄酒中，鉴定了以前从未发现过的新属（木霉菌属、嗜氢菌属等），确定了复杂的细菌群落，证实了部分细菌在葡萄酒中持续存在（Godálová er al., 2016）。

  利用基因组学技术可以对发酵中的功能核心微生物区系、功能基因和优势风味之间的生物相互作用网络进行分析。Chen et al.（2020）揭示了冰酒发酵过程中功能核心菌群（8个细菌属和9个真菌属）与24种挥发性化合物的形成具有显著的相关性。利用下一代测序（NGS）揭示了白酒窖泥中的核心微生物，总群落中有26％是新细菌种，但这些微生物的功能尚不清楚。在400年的酱泥样品中，己生菌的相对丰度显着增加，这种群落结构的转变可以解释为什么老窖对于高质量浓香型白酒生产很重要（Liu et al., 2017），而葡萄酒的最终质量也与微生物分类学组成有关（Hong et al., 2016）。

  Melcher et al.（2016）确定了普洱茶发酵前期和后期的核心微生物，发酵中真菌和细菌群落组成发生了显著变化，检测到主要由真菌产生的25种有毒代谢产物。此外，还可以将普洱茶中的核心微生物群落及其产生的酶相关联（Zhao et al., 2015）。Wu et al.（2017）利用鸟枪法宏基因组学重建了醋菌群中7种底物分解和20种主要风味物质形成的代谢网络，揭示了微生物在不同代谢途径中的分布差异，但没有揭示在整个发酵过程中任何给定物种的代谢潜力和作用。在微生物群落背景下剖析微生物的代谢作用仍然非常困难，宏基因组学和DNA条形码技术在评估微生物群落结构之间存在一定偏差（Sternes et al., 2017），其中主要的挑战是基于环境基因组信息重建微生物代谢相互作用网络（Hanson et al, 2014）。

  2 微生物群落动态变化与风味物质的关联

  微生物的相互作用对酿酒过程至关重要，已知有许多不同的微生物参与了葡萄酒风味和香气的形成。了解微生物多样性及其在整个过程中的相互作用可以提高我们对酿酒和葡萄酒复杂性的认识（Tempère et al., 2018）。尽管对葡萄酒微生物的研究历史悠久，但许多重大挑战仍有待解决。近年来，人们主要关注高通量测序（HTS）工具如元基因编码和鸟枪法宏基因组学在葡萄酒研究中的应用，通过这些工具可以更深入地描述微生物群落（Belda et al., 2017; Stefanini and Cavalieri, 2018; Sirén et al., 2019a）。部分研究仅限于描述微生物及其随时间的丰度波动，如完成葡萄酒发酵与发酵停滞的微生物群落变化（Sirén et al., 2019b），但关于不同微生物动态变化的时间和丰度的细节仍然不够清楚（Stefanini et al, 2016）。

  Howell et al.（2006）证实了酿酒酵母菌株之间的相互作用。多个酵母菌株在单菌、混合培养或混合样品中的代谢行为有着明显差异，这突出了一个菌株对其他菌株代谢行为的影响（Cheraiti et al., 2005）。微生物间的竞争性代谢相互作用往往在群落的结构和功能中起着至关重要的作用。以前来自单一和混合培养物的葡萄酒的代谢组学研究通常集中于GC-MS的目标分析和挥发物分析。uHRMS揭示了物种内部代谢组学差异，并提取和标注出可反映酵母物种之间重要差异的标记（Roullier-Gall et al., 2020）。此外，基于H1-NMR和GC-MS的代谢组学最近被用来识别在发酵期间区分两种酵母的单一和混合培养的代谢物。混合培养产生的22种代谢物中，其中15种在Lachancea thermotolerans（LT）的衰亡期才有区别，表明LT诱导的挥发性物质变化发生在LT衰亡期，而不是在其初始生长阶段（Peng et al., 2018）。

  在发酵中，任何微生物在群落环境中的代谢作用都可能会随着发酵时间的推移而变化，不同发酵阶段的微生物群落结构有明显差异。Wang et al.（2015）研究了不同批次香醋的16种主要风味代谢物的动力学，证实了不同批次间细菌群落演替和风味形成的一致性决定了镇江香醋的质量，从乳酸杆菌为主的发酵到以醋杆菌为主的发酵均产生了醋的主要风味物质（乳酸和乙酸），一些不占优势的属（如甲基杆菌）对风味形成也有贡献。此外，对14种不同酱香型白酒的群落多样性和挥发性物质剖面分析发现，含氮化合物与杆菌和曲霉的丰度呈正相关，酯类物质与乳酸杆菌和曲霉的丰度有关（Jin et al. 2019），Zepeda-Mendoza et al.（2018）研究了接种Oenococcus oeni和Bruttanomyces bruxellensis对葡萄酒挥发性酚形成的影响，发现取决于微生物群落结构和丰度；在红米酒自发酵过程中，风味化合物的类型和浓度也受到这些微生物群落变化的强烈影响（Ly et al., 2018）。

  3 小结

  中国传统发酵食品，如白酒、米酒、食醋、普洱茶等领域均应用组学技术深入研究微生物群落结构，从科学的角度解释和分析微生物对风味的贡献。目前的多数研究旨在研究发酵剂中相关的微生物区系，以及使用元组学测序分析和HS-SPME-GCMS在发酵结束时对芳香物质进行表征。葡萄酒酒精发酵是一个复杂的过程，它包括微生物种群之间复杂的动态相互作用，仅将重点放在单个分离菌株上的研究不足以全面了解微生物的代谢过程和葡萄酒风味的形成。目前，微生物相互作用的性质和调节微生物相互作用，种群动态和性能的机制尚不够清楚。

  多组学方法的应用对于提高我们对葡萄酒微生物组的了解至关重要，可用于破译微生物种群动态和预测最终葡萄酒产品的风味模型。揭示特定压力条件对微生物代谢的影响或鉴定特定香气形成的生物途径，这也体现了大规模测序作为控制酒精发酵的工具的巨大潜力，这对整个葡萄酒界和其他食品微生物行业也具有重大意义。