育种方法与技术岗位

  葡萄霜霉菌属于活体营养型专性寄生卵菌，严重威胁葡萄的产量和品质。已知不同菌株对葡萄致病力有显著差异，因此分离纯化霜霉菌单株对于葡萄-霜霉菌互作研究以及葡萄抗病种植挖掘具有更重要的意义。单菌长期扩繁既增加了菌株突变的积累（导致致病力下降），同时还会造成菌株污染和损失的概率。因此长期保存霜霉菌单菌株尤为重要。我们借鉴向日葵霜霉菌保存的方法，使用低温存储，使葡萄霜霉菌已经保存两年以上，并仍然具有较高的活力。以下为我们葡萄霜霉菌菌株纯化分离及保存方法的介绍。

  1、菌株分离纯化：田间采集带有霜霉病的葡萄叶片，使用清水冲洗后，背面朝上放于带盖的培养皿里，（培养皿中事先放置湿润的滤纸保湿）。培养皿放于25摄氏度的植物培养箱，光下培养1-2天，在体式镜下观察这些新长出的葡萄霜霉菌，选择边缘稀疏的霜霉菌，使用尖头的镊子取同一个孢子囊梗上的孢子囊。幼嫩的无核白叶片做成的叶盘，并且在叶盘上放置一滴无菌水，将取下的孢子囊放置于无菌水中。接菌的叶盘放于25摄氏度的植物培养箱，光下培养1天后，使用干净的滤纸，清除多余的水。叶盘生长4天后会长出稀疏的菌丝，这些菌丝再次使用尖头的镊子取同一个孢子囊梗上的孢子囊，接种于新的叶盘上。如此反复3-4次，即获得葡萄霜霉菌单株。

  2、菌株保存：获得的霜霉菌单株大量扩繁后，将菌丝和孢子囊收集到1.5 mL 离心管中，在液氮中速冻，随后在超低温冰箱中保存。

  3、菌株活化：保存有菌株的样品管放于冰上5 min，将孢子囊和菌丝的混合菌液被接种于幼嫩的无核白叶片做成的叶盘上（光下培养1天后，使用干净的滤纸，清除多余的水），在植物培养箱中培养6-7天后即获得新生长出的霜霉菌。

  我们利用该方法共分离保存有200株葡萄霜霉菌，并利用有代表性的葡萄霜霉菌对葡萄的抗病表型进行了检测。