病毒病防控岗位

任芳 董雅凤 张尊平 范旭东 胡国君

  葡萄卷叶病是葡萄上的重要病害，由多种葡萄卷叶相关病毒引起，葡萄卷叶伴随病毒7（Grapevine leafroll-associated virus-7，GLRaV-7）是葡萄卷叶病的病原之一，分布于我国主要葡萄产区，在赤霞珠、梅鹿辄和红地球等多个主栽品种中均有发现。病毒检测是葡萄无病毒苗木繁育及病毒病防控的关键环节，但在长期检测过程中发现，GLRaV-7在很多田间样品中检测较困难，存在常用检测引物检测不出导致漏检等情况的发生，推测与病毒浓度较低以及引物特异性不够等原因相关。因此，为进一步提高GLRaV-7检测效率和准确度，本实验室开展了GLRaV-7的RT-PCR检测新引物筛选及检测技术研究，筛选出1对灵敏度较高的RT-PCR检测引物，建立了相应的RT-PCR检测技术，进一步提高了GLRaV-7检测效率。

  1  材料与方法

  1.1 试验材料

  分别于5~9月不同时期采集疑似携带GLRaV-7的葡萄植株嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须、枝条以及11月冬季休眠枝条等不同组织部位样品作为检测供试材料。

  1.2 主要仪器及试剂

  RT-PCR检测所用PCR仪为T100TM Thermal Cyler（BIO-RAD，美国）。主要试剂包括：购自Promega公司的M-MLV反转录酶，购自大连宝生物公司（TaKaRa）的10 × PCR Buffer、dNTPs、Taq酶、DNA Marker DL2000等。

  1.3 总RNA 提取

  采用改良吸附柱法提取总RNA：（1）取葡萄样品约50 mg，放入塑料袋中，加入1 mL提取液研磨；匀浆转入事先加入NLS的离心管中，70℃保温10分钟，冰上放置5分钟，13000 rpm，离心15分钟；（2）取上清液600 μL，加入300 μL无水乙醇，颠倒混匀45秒，混合液加入吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃掉废液；（3）加入700 μL去蛋白液，室温放置2分钟，12000 rpm离心1分钟，弃掉废液；（4）加入700 μL清洗液，12000 rpm离心1分钟，弃掉废液；再加入500 μL清洗液，12000 rpm离心1分钟，弃掉废液；将吸附柱放回空收集管中，12000 rpm离心2分钟，弃掉废液；（5）取出吸附柱，放入新的离心管中，加50 μL DEPC水，室温放置1分钟，12000 rpm离心1分钟，所得RNA溶液–70℃超低温保存备用。

  1.4 检测引物

  根据文献报道，选择8对GLRaV-7引物（表1）作为本研究RT-PCR检测候选引物。采用8对引物分别对疑似携带GLRaV-7的葡萄样品进行RT-PCR检测，根据检测特异性和灵敏度选择最佳引物。

  1.5 RT-PCR反应体系

  反转录体系25.0 L：将5.0 L总RNA与1.0 L 0.1g/L随机引物和9.0 L水混合，95C变性5min后立即置于冰中冷却2min；加入5.0 L 5×MLV-RT buffer、1.25 L 10 mM dNTPs、0.5 L 200 U/L M-MLV和3.25 L DEPC水，经37C 10 min、42C 50 min、70C 5 min合成cDNA，–20 ℃保存备用。

  PCR反应体系25µL，包括2.5L cDNA、2.5µL 10×PCR buffer、0.5 µL 10 mM dNTPs、0.5 µL 10µM 互补引物、1.0U Taq酶，最后加DEPC水补足25µL。PCR 反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30~50 s，52~54℃ 30~45 s，72℃延伸45 s~1 min，35个循环后，72℃延伸7 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

  2 结果与分析

  分别采用8对候选引物对不同时期和不同组织部位的73个葡萄样品进行RT-PCR检测。结果表明，8对引物检出阳性样品数分别为6、0、3、4、9、11、11、6个（表2）。引物L7-F2/R2检测所有样品均为阴性，检测效果最差。检测阳性样品数最多的引物为L7-F6/R6和L7-F7/R7，其次为L7-F5/R5和L7-F8/R8。所有引物对不同组织部位样品的检测结果表明，几乎所有引物都只能对枝条样品检测为阳性，其余部位（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须）样品几乎全为阴性，其中仅个别老叶柄样品个别引物检测为阳性。因此，在采用该RT-PCR方法检测GLRaV-7时，不论何时采样，以枝条韧皮部样品为最佳。8对引物中，从阳性检出率、条带特异性等各方面比较，以引物L7-F7/R7检测效果最佳，其扩增目的条带明亮、特异，检出率最高，检测枝条样品效果较好（图1）。其次检出率较高的为引物L7-F6/R6，检测特异性较好的引物为L7-F8/R8，与L7-F7/R7相当（图1）。

  3 结论

  采用8对GLRaV-7候选PCR引物对73个不同时期和不同组织部位葡萄样品的检测结果比较，筛选出1对检测效果最好的引物L7-F7/R7，并建立了相应的RT-PCR反应体系：包括2.5L cDNA、2.5µL 10×PCR buffer、0.5 µL 10 mM dNTPs、0.5 µL 10µM 互补引物、1.0U Taq酶，最后加DEPC水补足25µL。PCR 反应条件：95℃3 min，95℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环后，72℃延伸7 min。该RT-PCR技术可用于田间葡萄样品中GLRaV-7的高效检测。并且，通过不同时期和不同组织部位样品的检测结果比较，确定了适宜GLRaV-7 RT-PCR检测的最佳样品部位为枝条，其检出率最高，老叶和老叶柄仅个别样品可检出，其余部位如嫩叶、嫩叶柄、卷须等几乎全部检测为阴性，不推荐作为检测材料，推测与这些部位中GLRaV-7病毒浓度偏低有关。