酿酒微生物岗

刘延琳

  葡萄酒酿造过程中，发酵温度对葡萄酒品质有重要的影响（刘文玉 2017; Kanellaki et al. 2013）。低温发酵技术是在酵母起酵后，环境温度要控制在相对较低的温度，并保持到发酵结束（靳华荣 2016）。随着设备和温控条件的改善，低温发酵（10-15℃）越来越多用于白葡萄酒和桃红葡萄酒的酿造，近几年研究者们引入低温发酵技术以增强年轻红葡萄酒的芳香特征（Massera et al. 2019）。研究表明，较低的发酵温度能够使代谢物反应彻底，防止芳香化合物的挥发，提高葡萄酒中的萜烯含量、增加乙酯和乙酸酯在总挥发性化合物中的比例，进而更好地保留葡萄酒的品种香气，增加发酵香气的产生；另一方面，低温发酵可以抑制乙酸和乳酸菌等产酸微生物的代谢和生长，降低葡萄酒中高级醇和挥发酸的含量，减少酒中酸腐气味物质的生成；同时也降低了发酵过程中其它细菌污染的风险（Molina et al. 2007; Torija et al. 2003; García-Ríos et al. 2016）。

  尽管低温发酵改善了葡萄酒的品质，但这种发酵方式也有其缺点：酿酒酵母的最佳生长和发酵温度为25-32°C，当发酵在低温下进行时，酵母的生长速率减缓，细胞的多种代谢过程发生变化，造成葡萄酒发酵缓慢，甚至发酵停止（Maturan et al. 2015; Ariel et al. 2011; Luo et al. 2015; 俞然等 2015; Massera et al. 2021），因此，低温酿造的葡萄酒品质取决于酵母对低温的耐受性。

  低温发酵对酿酒酵母生长代谢的影响

  1 酿酒酵母响应低温胁迫机制

  葡萄酒酿造过程中，由于酿造工艺和环境等因素的影响，葡萄酒中微生物会不断面临环境刺激和压力。微生物对环境刺激最简单的反应策略是感应环境变化，并使用细胞内特定的机制直接作出反应（Estéfani et al. 2016）。酵母对环境的应激反应是一种复杂的过程，环境温度降低对酵母细胞的生化和生理特性产生多种负面影响，不利于酵母的生长和繁殖；低温会损害细胞氮吸收能力，降低细胞利用氮源效率，进而影响细胞的分裂和传代（Beltran et al. 2007）；低温会影响两条DNA链与mRNA二级结构之间的相互作用，导致基因转录和翻译受损（Jones et al. 1996）；低温会使酵母细胞的刚性增加，导致膜脂质的流动性降低，抑制细胞膜的转运功能，严重影响细胞的代谢过程（Redón et al. 2011）；低温还会使蛋白质折叠速度减慢，降低构象的稳定性，影响蛋白质的功能；温度降低还会诱导蛋白质变性、膜蛋白横向扩散减慢，酶活性降低等（Schade et al. 2004; Murata et al. 2006; Aguilera et al. 2007）。因此，对酿酒酵母响应低温胁迫的分子机制研究显得十分必要。

  为了研究酿酒酵母响应低温胁迫的分子机制，研究者们通过基因工程、组学研究以及遗传学研究，表明酵母对于低温胁迫有多种响应方式（郑祖亮等 2015; Deed et al. 2017）。冷诱导下，酵母细胞中三种编码细胞壁甘露糖蛋白的基因表达量上升（Kondo et al. 1991; Kowalski et al. 1995; Fujii et al. 1999; Cohen et al. 2001）；海藻糖生物合成基因TPS1和TPS2表达量增加（Zenoni et al. 2010）；与膜流动性有关的去饱和酶 (Ole1p)以及与rRNA加工有关的Nsr1p酶合成量增加（Nakagawa et al. 2002; Yan et al. 1993）；硫同化途径和谷胱甘肽途径合成基因上调（García-Ríos et al. 2014）；低温下酵母细胞色氨酸的消耗增加（Tokai et al. 2000）；Kandror et al.（2004）研究表明应激反应元件 (STRE) 结合因子MSN/MSN4与低温反应基因的协调调节有关。Schade et al.（2004）发现，低温下的酵母细胞通过蛋白质的磷酸化和降解维持细胞正常的生理功能。

  因此，酿酒酵母对于低温胁迫的响应途径非常复杂，从细胞的功能角度出发，总结出酿酒酵母主要通过三个方面响应低温胁迫：

  （1）酵母细胞会通过提高细胞膜和细胞壁的生理生化功能抵御寒冷。在低温条件下，酵母细胞中的不饱和脂肪酸的磷脂比饱和酰基链的磷脂具有更低的熔点和更大的柔韧性，脂肪酸去饱和酶基因OLE1的表达量升高，膜脂中不饱和脂肪酸的浓度发生改变，从而提高了细胞膜的流动性（Córcolessáez et al. 2012）。低温也可能会改变酵母细胞膜的蛋白序列，如Gap1p（氨基酸渗透酶）、Tat1p（酪氨酸和色氨酸转运蛋白）等转运蛋白，增强细胞转运效率。低温下生长的酵母细胞通过泛素连接酶Rsp5p调节蛋白质泛素化，从而提高膜蛋白的运输功能，维持细胞膜正常的生理作用（Hernández-López et al. 2011; López-Malo et al. 2014）。磷脂、甾醇和鞘脂途径中相关基因的表达会影响酵母细胞在低温下的生长能力；脂质基因PSD1、LCB3、DPL1 和 OLE1的表达量增加，也会提高低温发酵过程中酵母的发酵活性；酵母细胞中的K+转运蛋白QDR2基因、细胞壁合成基因DSE1的表达水平升高，这在葡萄酒酵母适应寒冷过程中具有积极作用（Lopez-Malo et al. 2014; Schade et al. 2004）。

  （2）在低温环境下，酵母细胞会提高相关蛋白质的合成以促进代谢。温度降低会诱导参与碳水化合物代谢的代谢酶基因，包括转录因子编码基因HAP5和TYE7，以调控细胞代谢；还会诱导LCR 基因（HSP12、HSP26、HSP104和SSE2等）编码参与应激反应的热休克蛋白，这些功能上保守的蛋白质可防止蛋白质聚集；RNA解旋酶Ded1p在核糖体亚基扫描过程中熔化二级结构，对翻译的起始具有积极作用，即Ded1p通过解开冷稳定的mRNA二级结构，来提高翻译起始过程的效率（de la Cruz et al. 1999; Linder 2003）。低温作用下，与海藻糖代谢、糖原代谢途径相关的基因表达量增加，以促进蛋白质的正确折叠（Schade et al. 2004; Simola et al. 2000）。同时，参与核糖体合成的相关基因表达量升高，增加了核糖体合成效率，进而提高细胞中蛋白质的合成能力，有助于酵母适应寒冷环境（Tai et al. 2007）。

  （3）酵母细胞通过增加GPD1和GPD2等与甘油合成相关基因的表达量，提高胞内甘油合成水平，同时低温会诱导酵母细胞内渗透酶Stl1p的表达，以维持胞内外甘油的浓度和渗透压平衡，提高低温下细胞的存活率（Deed et al. 2015; Tulha et al. 2010）。

  2 提高酿酒酵母的低温适应性

  低温发酵的葡萄酒有更突出的香气和感官特征，深受消费者的喜爱。在葡萄酒酿造过程中，酿酒酵母的作用十分关键，但是酿酒酵母在低温下生长缓慢，不仅会影响酵母的生理生化特性，还会造成发酵停滞，增加了经济成本和能源需求。因此，提高酿酒酵母的低温耐受能力既可以更好的控制发酵进程，酿造更加优质的葡萄酒，还可以降低葡萄酒的生产成本，提高资源利用效率（Garcia-Rios et al. 2018）。

  近几年来研究者们通过多种方式提高酿酒酵母的低温耐受性。吴苏生等人（2015）利用低温锻炼技术提高酿酒酵母BH8的耐低温性，具体操作是：初始温度为25℃，进行梯度降温，降至13℃后进行恒温发酵实验。通过分析普通酿酒酵母和经低温锻炼的酿酒酵母BH8的发酵时间、葡萄酒理化指标等数据，结果显示BH8的发酵时间比对照菌株缩短2 d，但是与低温胁迫有关的抗性物质甘油、海藻糖和琥珀酸的含量降低，作者推测低温锻炼使酵母产生了耐受低温的能力。这种方法获得的低温耐受的酵母，其耐受能力只存在于低温状态下，当温度升高时，酵母的耐受能力会减弱或者消失，实际生产过程中，环境温度会有波动，当酿造温度高于或者低于低温锻炼的温度时，酵母的低温耐受能力会受影响，进而影响发酵进程。因此，在严格控制发酵温度的情况下，这种低温耐受酵母菌才可以发挥正常的生理功能，保证发酵的顺利进行。

  俞然等人（2003）利用紫外诱变技术对酿酒酵母进行定向选育，筛选出低温耐受的酿酒酵母R2。具体操作方法是：首先，使用紫外线照射酵母菌液，使菌液存活率在1%-30%，然后梯度稀释菌液，涂布于葡萄汁YPD平板上，13℃培养3 d，筛选出阳性单克隆，利用CO2失重法进行菌种鉴定，结果显示突变菌株发酵速率提高。这种筛菌方法可操作性强，但是工作量较大，成功率低。

  Garcia-Rios et al.（2018）利用种间杂交技术构建了酿酒酵母和耐寒菌株（Saccharomyces uvarum）的杂交种，以改善葡萄酒酿酒酵母菌株在低温下的酿酒特性，在不同温度条件下（15℃和28℃）对白葡萄汁进行发酵，检测亲本和杂交菌株的表型差异。结果表明，杂交是获得低温耐受酵母菌株的有效方法，这在遗传上取决于许多基因的表达（多基因特征）。由于这种种间杂交方法不被认为是转基因生物，因此基因改良的菌株可以迅速转移到葡萄酒行业。Ota et al.（2019）的研究中，用23种天然的酿酒酵母菌和天然的耐低温酵母菌进行种间杂交，用杂交种在12°C下对模拟葡萄汁中进行发酵，研究其对葡萄酒香气的影响。结果表明，杂交种在低温环境下的发酵速率和天然耐寒菌株的发酵速率相似，且能使葡萄酒有更加丰富的香气特征。由于两个基因组之间复杂的相互作用增加了等位基因的多样性，并减少了有害的等位基因的影响，因此，杂交育种可以有效地改良和筛选低温耐受酵母菌株。

  研究人员通过基因敲除技术敲除酵母中编码甘油代谢的FPS1基因，突变体菌株细胞内的甘油会大量积累，结果发现fps1Delta细胞在冷冻储存7 d后获得了对冷冻应激的耐受性，并在保持了较高的发酵能力（Izawa et al. 2004）。另外，通过构建酿酒酵母中甘油脱氢酶基因（ARA1、GCY1、GRE3E、DELTA）的四倍基因敲除突变体，发现甘油脱氢酶活性降低导致细胞内甘油水平升高，该突变体比野生型耐寒菌株对冷冻胁迫表现出更高的耐受性（Izawa et al. 2004）。这种方法获得的酵母菌可以有效的应对低温胁迫，但是可能会导致细胞的产乙醇能力降低，抑制细胞的其他代谢通路，影响细胞的正常生理生化功能等，造成葡萄酒不良风味的产生（Pigeau et al. 2007）；同时由于参与酵母低温耐受的基因数量众多，会使得工作量大，菌株筛选效率低下（Chandler et al. 2004；Hillenmeyer et al. 2008）。

  以上方法虽然可以获得相应的低温耐受菌株，但是没有鉴定到调控酵母低温耐受的关键基因，无法从根本上指导低温耐受酵母的改良和筛选。QTL定位是对数量性状位点进行分析筛选鉴定，寻找基因组上与数量性状相关性最强的遗传标记。用此方法定位得到的主效基因，可直接应用于低温发酵酵母育种和遗传改良工作中。本实验室前期研究中，利用遗传学手段，对本土耐低温酵母的主效QTL进行定位，获得了两个目的基因NAT1和YOR365C，然后通过相互半合子分析（RHA）和序列多态性分析等方法对主效基因进行鉴定, 结果发现NatA酶的辅助亚基NAT1基因是控制本土耐低温酵母的主效基因，为解析酵母低温耐受的分子机制奠定了基础（Feng et al. 2018）。