熟期调控
方海猛 杨国顺 刘凯杰 罗飞雄 刘昆玉 许延帅
葡萄(Vitis vinifera L)全国种植面积到2018年已达80万公顷以上，国内葡萄成熟期主要集中于7~9月份，季节性供大于求，影响葡萄的经济价值。近些年，云南、广西、广东、湖南等南方地区开展应用了葡萄延后栽培、一年两收等栽培技术，通过错开‘巨峰’、‘夏黑’和‘阳光玫瑰’等鲜食葡萄的成熟期，实现错峰上市，提高了葡萄的经济效益。‘夏黑’延后栽培葡萄果实与正常栽培相比呈现出可滴定酸含量低、果粒偏小等现象。
有机酸的组成和含量是决定果实风味品质的重要因子。葡萄果实中主要含有苹果酸、酒石酸和少量的柠檬酸、琥珀酸，苹果酸和酒石酸占总酸含量的90%以上，其中苹果酸对果实风味品质和酿酒品质至关重要。在葡萄果实中没有高含量的柠檬酸，酒石酸不参与各类初级代谢，而苹果酸能在果实成熟期参与糖积累和糖酵解抑制等过程，因此苹果酸是葡萄成熟过程中唯一被大量代谢的高含量有机酸。葡萄果实中的苹果酸是由葡萄糖经糖酵解途径形成的丙酮酸转化而成(图1)。果实发育过程中，苹果酸和酒石酸均呈下降趋势，酒石酸含量的下降程度小于苹果酸，苹果酸更易参与呼吸作用和易通过三羧酸循环降解，果实发育过程中体积变大对苹果酸的稀释也是苹果酸下降的主要原因之一。研究苹果酸代谢对调控果实有机酸和风味品质具有重要意义。苹果酸的合成主要受磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)和细胞质NAD依赖性苹果酸脱氢酶(Cytoplasmic NAD-dependent malate dehydrogenase, NAD-MDH)的调控；PEPC将磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate, PEP)缩合成OAA，而MDH能催化草酰乙酸(oxaloacetate, OAA)与苹果酸的可逆反应；细胞质NADP依赖的苹果酸酶(Cytoplasmic NADP-dependent malic enzyme, ME)负责调控苹果酸的降解，能将苹果酸脱羧为丙酮酸，催化二者的可逆反应。
研究发现，桃(Amygdalus persica L)果实中MDH活性随成熟而降低，与苹果酸的积累与降解变化一致；ME还参与植物光合作用；其活性受温度影响较大；PEPC活性在果实发育早期呈现高水平，其活性随着果实中苹果酸含量的变化而变化，在果实成熟之前活性降低，PEPC活性会受到苹果酸含量的抑制。
钾元素是影响果实品质的重要矿质元素，在果实光合作用、呼吸作用、糖酸代谢、细胞稳态和信号传导等过程中起重要作用。葡萄果实在转色期后成为强有力的K+库、K+在成熟过程中含量不断增加，K+离子对酸碱平衡及葡萄酸度的控制起着关键作用。在其它水果中，钾对调控有机酸代谢同样重要，钾能抑制苹果(Malus pumila Mill.)果实中苹果酸积累，增施钾肥可提高番茄(Lycopersicon esculentum Miller)果实可滴定酸含量。
本研究通过比较两种栽培模式下葡萄发育过程中果实苹果酸含量、苹果酸代谢相关基因表达和钾元素含量变化，并探究钾元素和苹果酸之间的关系，为改良‘夏黑’葡萄延后栽培果实风味品质及之后的研究与育种提供科学依据。
第1章 1材料与方法
1.1 试验材料
试验地点在湖南长沙湖南农业大学干杉葡萄基地(北纬28°8′21′′, 东经113°11′54′′)。试验品种为9年生‘夏黑’葡萄，株行距为2.8×1.8 m，树形为独龙干“厂”字形树形，“V”形叶幕，钢架避雨大棚。试验分为正常栽培和延后栽培两种不同栽培模式，每种模式各选定9株长势一致的植株，每相邻3株为1个重复，共设3次重复，随机区组设计。两种栽培模式的果实均于花后4周开始每隔7 d采样。每个重复随机均匀采取500 g果粒，其中一部分立即投入液氮中速冻后带回实验室于–80 ℃冰箱中保存备用，用于RNA的提取；另一部分使用冰盒带回实验室，用于果实纵横径、单粒重、可滴定酸含量、苹果酸含量以及钾元素含量的测定。
1.2 栽培技术方法
‘夏黑’正常栽培(CK)管理同常规；延后栽培(T1)栽培技术参照王莉等的方法，并做修改如下：于花前3周(2021年4月15日)去除正常果实花序，并对1年生枝条进行长放，在2021年4月30日对长放主梢第6节位进行修剪，并暂留顶端夏芽副梢继续生长，10 d后待冬芽发育饱满时剪除顶端副梢，促使顶端冬芽萌发并进行开花结果，其它栽培管理同正常栽培。
1.3 果实品质测定
用游标卡尺测果实纵横径；用电子天平测果实单粒重；用NaOH酸碱滴定法测定果实可滴定酸含量。
1.4 苹果酸含量的测定
苹果酸的测定采用高效液相色谱法并稍做修改如下：将葡萄果实样品打浆、先用纱布过滤去除固体残渣，将溶液进行30 ℃超声20 min，取1.0 mL上清液置于2 mL离心管；再10 000 rpm离心12 min；取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，待上机检测。Agilent1260高效液相仪，色谱柱为Agilent，ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6*250 mm、5 μm；流动相设置为0.1%磷酸，流速0.4 mL/min；柱温40 ℃，进样量10 μL；紫外检测器1260 VWD，检测波长设定为210 nm。试验所用苹果酸标准品购自北京索莱宝科技有限公司。
1.5 钾元素含量测定
每一时期果实样品中钾元素含量的测定采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，仪器：电感耦合等离子体质谱仪，方法参照国标(GB 5009.268-2016)。
1.6 苹果酸代谢相关基因表达测定
使用全能型去多糖多酚植物RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技股份有限公司, 北京)提取葡萄果实总RNA。使用Takara Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒(Takara，大连)反转录合成cDNA。
VvPEPC、VvMDH、VvME基因，设计PCR引物，以UBI (XM_002266714)作为内参基因。内参及目的基因引物均交由擎科生物科技有限公司合成(表2)。qRT-PCR总反应体系为20 µL：cDNA模板1 µL，上游引物0.8 µL、下游引物0.8 µL，反应SYBR® Premix ExTaqTM 10 µL，ddH2O 7.4 µL。反应程序为：95 ℃ 预变性1 min；95 ℃ 变性10 s，55 ℃退火20s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，4次重复(王西成等，2015)。使用ΔΔCt法对荧光定量PCR扩增数据进行处理，通过计算2-ΔΔct值换算目的基因的相对表达量。qRT-PCR仪器为ABI 7300 Real Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, USA)。
1.7 数据统计分析
试验数据使用Excel 2013进行作图分析，SPSS 26.0进行显著性、相关性分析。
第2章 2结果与分析
2.1 延后栽培对果实品质的影响
延后栽培和正常栽培果实均在5~6 WAF为转色期；在发育后期延后栽培果实着色差于正常栽培(图2)。
正常栽培和延后栽培果实纵径均在4~8 WAF呈现增长趋势、在8 WAF后趋于稳定不变；正常栽培和延后栽培果实横径均在4~9 WAF呈现增长趋势、在9 WAF后趋于稳定不变；延后栽培果实纵横径均显著低于同时期正常栽培果实(图3A; 图3B)，延后栽培葡萄生长发育期间的气候差异可能抑制了果实膨大。果实生长发育过程中，延后栽培果实单粒重均显著低于同时期正常栽培果实(图3C)。
延后栽培和正常栽培果实可滴定酸含量均呈整体下降趋势，可滴定酸含量均在6~7 WAF显著降低；在6~11 WAF延后栽培果实可滴定酸含量始终低于正常栽培(图4)。
2.2 延后栽培对果实苹果酸, 钾元素含量的影响
延后栽培果实苹果酸含量呈现先上升后下降的趋势，在5 WAF积累到生长期最大为14 206.16 μg/mL，在11 WAF下降到939.18 μg/mL；正常栽培果实苹果酸含量呈现为整体下降的趋势，苹果酸可能在4 WAF积累到最大，在11 WAF果实苹果酸含量为1 330.86 μg/mL、高于延后栽培；在5~6 WAF，延后栽培和正常栽培果实苹果酸含量均呈显著降低；在6~11 WAF延后栽培果实中苹果酸含量均低于正常栽培，这与延后栽培可滴定酸含量低于正常栽培表现一致；延后栽培果实苹果酸最大积累量高于正常栽培，而在果实发育后期低于正常栽培，延后栽培苹果酸的降解大于正常栽培(图5A)。
随着果实生长发育，延后栽培果实钾元素含量呈现先上升后下降再上升再下降的趋势，而正常栽培果实钾元素含量呈现一直上升的趋势。在5 WAF、9 WAF果实钾元素含量延后栽培显著高于正常栽培，其余时期二者钾元素含量均无显著性差异；延后栽培在果实发育后期(9~10 WAF)显著降低，在10、11 WAF延后栽培果实钾元素含量低于正常栽培(图5B)。
钾元素含量和苹果酸含量相关性分析结果表明，延后栽培果实钾元素含量和苹果酸含量呈极显著负相关，相关系数为-0.524；正常栽培果实钾元素含量和苹果酸含量也呈极显著负相关，相关系数为-0.873；果实钾元素可能直接或间接参与苹果酸的调控。
2.3 延后栽培对苹果酸代谢相关基因表达的影响
荧光定量PCR结果表明，不同时期延后栽培与正常栽培果实中苹果酸代谢相关基因的相对表达量均有差异。
延后栽培果实在生长发育过程中VvPEPC相对表达量呈现先下降后上升的趋势，正常栽培VvPEPC相对表达量则呈现为一直下降的趋势；延后栽培在4 WAF果实VvPEPC相对表达量显著低于正常栽培；延后栽培和正常栽培在5~11 WAF各时期果实VvPEPC相对表达量均无显著性差异(图6A)。延后栽培果实在生长发育过程中VvMDH相对表达量呈现出先下降后上升再下降最后再上升的趋势，在8~9 WAF出现显著上升；正常栽培呈现为整体下降趋势；在6、9、11 WAF延后栽培果实中VvMDH的相对表达量显著高于正常栽培，其余时期延后栽培和正常栽培VvMDH基因相对表达量均无显著性差异(图6B)。延后栽培和正常栽培果实在生长发育过程中VvME相对表达量均呈现出整体上升的趋势；在4 WAF和9~11 WAF果实VvME相对表达量均表现为延后栽培显著高于正常栽培，其余时期延后栽培和正常栽培VvME基因相对表达量均无显著性差异(图6C)。
2.4 苹果酸代谢相关基因表达量与苹果酸含量的相关性
正常栽培葡萄果实VvPEPC、VvMDH相对表达量与苹果酸含量均呈极显著正相关、VvME相对表达量与苹果酸含量呈极显著负相关，相关性系数分别为0.732、0.742、-0.418 (表1)。延后栽培葡萄果实VvPEPC基因相对表达量与苹果酸含量呈显著正相关，相关性系数为0.573；延后栽培葡萄果实VvMDH基因相对表达量与苹果酸含量呈极显著正相关，相关性系数为0.589；延后栽培葡萄果实VvME基因相对表达量与苹果酸含量呈负相关，相关性系数为-0.481(表1)。
3 讨论
果实中有机酸受果实发育的调控，受遗传特性、自然环境、栽培措施、营养元素等多种影响因子的共同作用影响，其含量是由果实生长发育过程中有机酸合成与降解两者共同决定。
三羧酸循环消耗与果实体积变大均可导致苹果酸含量降低，延后栽培和正常栽培葡萄果实苹果酸含量均在转色期前达到最大，随后一直下降，这可能是由于上述原因导致的。延后栽培葡萄果实苹果酸含量在转色期后低于正常栽培，苹果酸是成熟期唯一被大量代谢的高含量有机酸，这是转色期后延后栽培可滴定酸含量始终低于正常栽培的原因。一年两收栽培的‘巨峰’夏果在转色期后其果实苹果酸含量显著低于冬果，通过增温处理可以降低冬果苹果酸含量，延后栽培‘夏黑’葡萄所处的生长发育环境温度高于正常栽培的‘夏黑’和一年两收栽培的‘巨峰’冬果，因此高温可能是造成延后栽培果实苹果酸含量较低的重要原因。
VvPEPC、VvMDH、VvME作为参与果实苹果酸代谢的部分关键酶编码基因，其在果实发育过程中的相对表达量均受到延后栽培的影响。在葡萄果实发育早期，延后栽培和正常栽培果实中VvPEPC相对表达量均呈现高水平，这与果实发育早期大量积累苹果酸的情况相符合；果实发育中期VvPEPC相对表达量均呈较低水平，可能是此时期果实中高含量苹果酸限制了PEPC酶的活性。在8~11 WAF，延后栽培果实VvPEPC基因的相对表达量高于正常栽培，VvPEPC基因编码酶主要调控苹果酸的合成，但延后栽培果实苹果酸含量却低于正常栽培，这可能是因为延后栽培果实VvME基因的相对表达量远高于正常栽培，导致了延后栽培果实苹果酸的降解速率远大于正常栽培，从而造成了延后栽培果实苹果酸含量低于正常栽培，VvME基因的高表达可能是延后栽培果实发育后期苹果酸含量较低的重要原因。在果实发育后期，延后和正常栽培果实中VvME基因均呈现高水平表达，这与苹果酸大量降解表现一致；延后栽培果实中VvME基因表达量显著高于正常栽培，可能是延后栽培葡萄生长发育后期环境温度高而增强了ME酶的活性。
延后栽培和正常栽培葡萄果实PEPC相对表达量与苹果酸含量均呈显著性正相关，这说明了VvPEPC基因为葡萄果实苹果酸合成的关键调控因子。延后栽培和正常栽培葡萄果实VvMDH相对表达量与苹果酸含量均呈极显著性正相关，VvMDH能调控苹果酸合成。正常栽培和延后栽培葡萄果实VvME相对表达量与苹果酸含量均呈负相关，VvME基因的表达与苹果酸的降解之间关系密切。
延后栽培葡萄果实纵横径较正常栽培小，王冬至等人通过微喷弥雾适当的降低葡萄果园温度，可使‘无核白’葡萄果实体积明显增加，表明温度对果粒大小影响较大，湖南省葡萄工程技术研究中心实验室前期的研究也发现延后果的体积显著变小，因此本研究延后果果粒变小可能与8~9月份气温过高影响了果实膨大有关。正常栽培葡萄发育过程中果实中钾元素含量一直增加，而延后栽培在发育后期果实中钾元素含量出现显著下降的现象，这与钾元素含量在葡萄果实成熟过程中不断增加的结论不一致，可能是因为土壤缺乏钾元素而供钾不足或者温度影响了土壤供钾能力的原因。延后栽培和正常栽培葡萄果实钾元素含量与苹果酸含量均呈极显著负相关，相关研究也得到了钾能抑制果实苹果酸积累的结论，这可能是因为钾影响或直接参与了果实苹果酸代谢，进而抑制了苹果酸的积累；合理施用钾肥可调控葡萄果实苹果酸含量、提高果实风味品质。
本研究通过比较两种栽培模式下葡萄果实苹果酸和相关基因表达的差异性及果实品质、钾元素含量变化，结果得出延后栽培葡萄果实纵横径、单粒重和可滴定酸含量低于正常栽培果实，延后栽培和正常栽培葡萄果实苹果酸含量均在转色期前达到最大，随后一直下降；延后栽培苹果酸的降解量大于正常栽培。在4~11 WAF，延后栽培和正常栽培果实VvPEPC基因和VvMDH基因的相对表达量差异不明显；在9~11 WAF延后栽培果实VvME基因相对表达量显著高于正常栽培。在果实发育后期延后栽培苹果酸的降解速率远大于正常栽培，因此VvME基因的高表达可能是延后栽培果实发育后期苹果酸含量较低的重要原因。研究结果为改善果实风味、进一步研究有机酸代谢分子机制以及调控果实有机酸提供一定的科学依据。