病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 张尊平 任芳 胡国君

  国际病毒分类委员会将芜菁黄花叶病毒科划分为3个属，分别为芜菁黄花叶病毒属（Tymovirus）、玉米细线病毒属（Marafivirus）和葡萄斑点病毒属（Maculavirus）。这3个属的RNA病毒成员一般具有长度6.0-7.5kb的基因组。侵染葡萄的此类型病毒已报道5种，即葡萄斑点病毒（GFkV）、葡萄红球病毒（GRGV）、葡萄西拉病毒1（GSyV-1）、葡萄星状花叶相关病毒（GAMaV）和沙地葡萄叶脉羽化病毒（GRVFV）。其中，GFkV和GRGV属于Maculavirus，GSyV1、GAMaV和GRVFV属于Marafivirus。已有研究表明GFkV、GRGV、GAMAV和GRVFV与葡萄斑点复合病相关。葡萄斑点复合病是一种分布于世界各地的主要葡萄病毒病之一，由几种病害类型组成，包括葡萄斑点（FK）、葡萄星状花叶（AM）、沙地葡萄坏死和沙地葡萄羽化等。AM是最早在美国加利福尼亚发现的葡萄斑点复合病类型，它能通过嫁接进行传播，其症状特征是在几个葡萄品种叶片上有半透明或褪绿的星状斑点，也导致沙地葡萄的初级和次生叶脉产生脉明症状。病毒病防控岗位于2014年在大连市的‘巨玫瑰’葡萄上发现了明显的叶脉褪绿症状，这些病症与AM极为相似，因此当时推测可能的病原为GAMaV，但在该样本中未检测到。2017年，为了确定感病葡萄样本中可能存在的病毒种类，采用了小RNA测序（sRNA-seq）和RNA测序（RNA-seq）对其进行了病毒鉴定，发现了一种新的葡萄病毒，命名为葡萄玉米细线病毒属相关病毒（grapevine associated-marafivirus，GaMV），并对我国葡萄GaMV进行了检测和基因序列分析。

  1 材料和方法

  1.1 试验材料

  2014年，从大连的一个葡萄园采集到一株具有明脉症状的‘巨玫瑰’葡萄（图1a，b）。从感染的葡萄上繁殖的插条扦插成活后，其叶片也表现出脉明症状（图1c, d和e）。2017年春季，采集病叶在液氮中快速冷冻，通过干冰运送至百迈克生物科技公司。

  1.2 研究方法

  1.2.1 高通量测序和生物信息学分析

  提取叶片总RNA，并构建sRNAs cDNA文库，采用Illumina HiSeq™2000系统进行sRNA-Seq。从原始读数中去除<18nt或>30nt的序列、低质量的、包含PolyA和N的序列，以获得过滤后的数据。通过使用VirusDetect分析小RNA数据，确定了潜在病毒的序列。对于RNA-seq，使用EpicentreRibo-Zero rRNA Removal Kit（Epicentre，Madison，WI，USA）从总RNA提取物中去除核糖体RNA。然后，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit（Illumina，San Diego，CA，USA）使用核糖体RNA缺失RNA样品构建cDNA文库，该cDNA文库在Illumina HiSeq 4000平台上以成对的150bp测序。比对上的葡萄基因组（PN40024组装12X）的序列，使用hisat软件移除。未比对上的序列通过VirusDetect软件进行拼接和BLAST分析。

  1.2.2 GaMV基因组扩增及序列分析

  根据contigs序列设计了5对引物，用于扩增GaMV基因组序列。回收、纯化PCR片段，将其克隆到零背景pTOPO-Blunt载体（Aidlab，中国，北京）。每个PCR产物至少3个阳性克隆送上海生物工程技术公司进行了测序。采用SMARTer®RACE 5’/3’Kit （TaKaRa）试剂盒对GaMV的5’和3’UTR进行扩增。

  1.2.3 GaMV不同分离物序列分析

  采用NCBI在线的ORF Finder软件分析序列潜在的ORFs。保守结构域通过CD工具来分析。Emaraviruses的核苷酸和氨基酸的序列比对通过ClustalW软件进行。采用MEGA7.0对RNA1-4编码的蛋白进行进化树分析。

  1.2.4 嫁接传染实验

  2019年7月，从感染GaMV的葡萄上采芽嫁接到2年生的Beta葡萄幼苗上，设5个重复。用于嫁接的贝达苗经检测，不携带GAMV和中国报道的其他主要病毒，且无病毒病症状。接种后3、6和12个月，监测嫁接葡萄的症状发生情况。提取被嫁接苗的RNA，采用两对引物（RP1a/1b和CP1a/1b）扩增GaMV的RdRp和CP基因序列，以确定样品是否被传上GaMV。

  1.2.5 田间样品GaMV检测

  为明确我国GaMV的流行情况，从我国21个省市随机采集了71个品种516株葡萄，采用RP1a/1b和CP1a/1b引物进行GaMV的检测。

  2 结果与分析

  2.1 高通量测序结果分析

  对巨玫瑰葡萄病叶中的sRNA和RNA进行测序，过滤得到18,599,455和602,231,929条序列。采用VirusDetect软件对序列进行分析，鉴定出样品中潜在的病毒序列。sRNA-Seq序列显示17个长度为55~286nt的contigs与GAMaV（AOX24075）的多聚蛋白同源，覆盖率为26.6%；RNA-Seq数据显示有14个长度为206~4866nt的重叠群与燕麦蓝矮病毒（AAC57874）的多聚蛋白同源，覆盖率为94.6%。这些结果表明在巨玫瑰葡萄样品中存在一种潜在的Marafivirus，我们暂定将其命名为葡萄相关Marafivirus（GaMV）。来自sRNA-seq和RNA-seq数据的50,789个sRNA和12,937个RNA能够比对上GaMV（图2）。

  2.2 GaMV基因组序列及分析

  根据contigs序列设计引物，RT-PCR扩增了GaMV JMG分离物的5个重叠片段，并通过重叠的公共序列（一般>100bp）组装成一个连续的序列。此外，我们还利用3’ cDNA末端快速扩增（RACE）获得了3’个非翻译区（UTR）的完整序列，并通过5’ RACE获得了5’端的部分序列。最终，获得了GAMV的近全基因组（GenBank登录号：MZ422607），共6346bp，不包括PolyA尾部序列。为明确GaMV与Tymoviridae科其它成员之间的关系，构建了一个系统发育树。进化树分析使用了所有已确认的Marafivirus，Maculavirus和Tymovirus成员。分析结果显示，GaMV与其它marafivirus成员聚在一起（图3）。

  2.3 GaMV嫁接传染特性

  所有嫁接的‘贝达’葡萄都表现出明显的脉明和褪绿斑点症状（图4 a-c）。嫁接12个月后，5株‘贝达’葡萄用两对特异的PCR引物均检测出GaMV（图4 d）。未嫁接植株GaMV检测结果呈阴性，且未表现症状。这些数据表明，GAMV可以通过嫁接传染。

  2.4 田间样品GaMV检测

  采用引物CP1a/1b和RP1a/1b对516份样品进行RT-PCR检测，阳性样品分别为23份(4.46%)和12份(2.33%)，表明前一对引物比后一对引物检测效果好。合计检测到阳性样品26个，占总样品的5.04%，其中，北京1个、辽宁21个、宁夏2个、山东1个、四川1个。

  2.5 不同分离物GaMV CP基因序列同源性及进化树分析

  研究获得了20个GAMV分离物的CP序列，分析了GAMV分离物之间的遗传多样性。这些分离株的序列已登录GenBank。除ML2外，其余分离株在的3个初始测序克隆的核苷酸同源性均>99.0%的。因此，对菌株ML2进行了更多的克隆测序，并鉴定出以ML2克隆3和ML2克隆5为代表的两种变异类型。GAMV分离物的CP在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为91.7-100%和96.7-100%。基于CP的系统发育树揭示了三个定义明确的类群的存在。主要菌株属于群I，而菌株ML2和LF分别属于群II和群III（图5）。