蓝莓种质资源鉴定与新种质创新岗位

 

  0 引言

 

  我国蓝莓栽培面积从2001年的24hm2增加到2017年的46,891 hm2，产量从0增加到114,905t，近几年发展速度尤为迅速。生产中几乎完全依赖引进品种，缺少拥有自主知识产权、适应我国复杂气候条件且能大面积推广的优良新品种，这与我国迅猛发展的蓝莓产业不相适应，所以，培育具有自主知识产权的、适应我国气候特点的蓝莓新品种迫在眉睫。我国蓝莓新品种选育起步较晚，虽然国内多所科研院校从“十一五”甚至更早依托多项育种项目开展蓝莓育种工作，但育种进程整体缓慢，除了缺乏优良的育种材料外，获得的杂交种子不能萌发成苗或萌发率低是重要影响因素。对于常规杂交育种，让每一粒珍贵的杂交种子萌发成苗是基础，解决这一关键问题对于蓝莓育种的顺利实施具有重要意义。

 

  很多植物的种子均存在休眠，即使在适宜的萌发条件下（温度、水分、氧气等）仍不能萌发或萌发困难。蓝莓种子存在很强的休眠特性，据报道直接播种需要55d才能出苗，且萌发率仅为4%。出苗困难的原因可能是种皮硬厚且质密，导致胚芽难以突破、缺乏必要的激素或生理上未完全成熟等造成的。赤霉素（GA3）作为一种能够打破种子休眠的植物激素，被广泛用于种子破休眠。研究发现赤霉素对蓝莓种子萌发有很明显的促进作用，发芽率在16%-41%之间，但不同研究确定的赤霉素的处理浓度、时间不尽相同，其中丁亦男等发现50mg/L浓度下浸种12小时种子萌发率和发芽势最高，在纱布上发芽率为16%，王光野 等先用35% 盐酸处理，再用200mg/L赤霉素溶液处理蓝莓种子，发芽率为15%，刘肖等使用400 mg/L赤霉素浸泡杂交种子24 h后播种，种子发芽率为41%。鉴于蓝莓种子萌发率低，近几年研究者们开始尝试组培无菌播种，效果差异较大，其中孙书伟等经筛选发现低温储藏八周、采用种子刻分播种、使用1 /3 改良MS + NAA 0.05 mg /L + ZT 0.5 mg /L 配方的培养基培养40d后，蓝莓种子发芽率为16.9%。甄成等将蓝莓种子在培养基上无菌培养，接种24 d内平均发芽率达82.88%，萌发率显著高于孙书伟等的报道。此外，研究者们对播种基质、基质pH值及温度等条件进行了筛选，得出蓝莓种子25℃条件下，在pH为5的砂质土壤中萌发率较高。

 

  综上，蓝莓种子破休眠及萌发已取得进展，可通过上述方式获得一定数量的杂交苗，然而百分之十几至百分之四十的种子萌发率远远不能满足蓝莓育种的需求，造成极其珍贵的杂交种子严重损失。虽然利用组培方式进行无菌接种，种子萌发率可达到80%以上，但经本育种实验室实际操作发现，由于蓝莓种子细小，萌发的幼苗细弱、质地脆嫩、根系不发达，从培养基移栽至基质过程中极易损伤导致死苗，成苗率低，且接种、移栽耗时耗工，运行成本过高，对于进行大规模杂交育种获得的成千上万的蓝莓杂交种子而言组培无菌播种可操作性、可行性不高。

 

  休眠和萌发是种子对复杂环境的适应特征，受基因型、成熟度、储藏条件及萌发环境的影响，基于此，本试验意从种子储藏条件、破休眠试剂浓度、播种基质等方面，摸索优化一套方便快捷、可操作性强、低成本的蓝莓种子高效萌发及快速成苗的完整方案，为蓝莓杂交育种顺利开展奠定基础。

 

  1 材料与方法

 

  1.1 材料

 

  试验在辽宁省果树科学研究所连续4年进行，2014年-2015年在人工气候室进行蓝莓种子破休眠、基质筛选和储藏条件筛选，于每年7月底采收蓝莓品种‘蓝丰’（Bluecrop）、‘北陆’(Northland)和‘杜克’（Duke）完全成熟的蓝莓果实，利用匀浆机加水匀浆，收获沉底杂交种子，挑选饱满成熟的种子按试验设定的不同处理储藏备用。2016年-2017年在前期试验基础上利用杂交种子在育苗温室进行播种条件的验证和快速成苗条件优化。种子采收同前，自然阴干备用。

 

  1.2 方法

 

  1.2.1 赤霉素处理浓度筛选

     

  赤霉素浓度与种子破休眠和萌发密切相关。本试验对赤霉素浓度分别设0（对照），12.5，25，50，100，200，400，800mg/L 8个处理。选取蓝莓品种‘蓝丰’、‘北陆’和‘杜克’饱满、成熟的种子（新鲜种子，现取现用），100粒/处理。种子用滤纸包裹后在赤霉素溶液中浸种20h，用清水冲洗备用，碎水苔（智利进口，购自青州大汉农业科技有限公司）充分吸水后平铺于底部带孔的泡沫箱（30cm×50cm×15cm）内，水苔厚度约7cm，备用种子点播于水苔上，并覆盖1cm厚的水苔（下同），采用人工气候箱进行培养，培养条件设定：每天光照12h，光照强度50lx，温度25℃，黑暗12h，温度15℃，湿度60%，培养期间视基质墒情补充水分，含水量在60%-80%之间。30d后观察并统计萌发率（以种子萌发破土而出为标准），每10d统计1次。

 

  1.2.2 储藏方式筛选

     

  储藏方式是影响种子活力的重要因素。本试验设新鲜种子（对照）、新鲜种子4℃储藏（相对湿度80%，密封）、新鲜种子-20℃冷冻、自然阴干室温储藏、自然阴干4℃储藏、自然阴干-20℃冷冻6种储藏方式处理，储藏时间3-6个月。‘北陆’种子每100粒为1组，根据已确定的最佳赤霉素浓度处理，播种于筛选确定的最佳基质中。培养条件同1.2.1。

 

  1.2.3 基质筛选

     

  播种基质是种子萌发的重要条件。本试验对播种基质设水苔、草炭、细河沙、园土及混合营养土（草炭：园土：腐熟牛粪/有机肥=2：1：0.1，1-1.5kg 硫磺/ m3）5个处理，选取‘北陆’新鲜的饱满种子，每100粒为1组，根据筛选确定的最佳赤霉素浓度处理种子后分别播种至上述5种基质中，前3个月培养条件同1.2.1，根据萌发率分析基质对萌发率的影响，其后移至育苗温室生长，以幼苗株高为指标，判断基质对幼苗后期生长的影响（备注：蓝莓幼苗侧枝发生量与密度密切相关，密度小，则侧枝发生量大，为避免幼苗密度对侧枝发生量影响的误差，本试验仅以幼苗株高为指标，不涉及其他生理指标）。

 

  1.2.4 快速成苗条件优化

 

  蓝莓种子高效萌发和快速成苗受种子成熟度、破休眠、储藏条件、基质及萌发环境综合因素的影响，2016年-2017年在前期试验的基础上，在育苗温室优化一套完整的蓝莓杂交种子快速成苗技术并进行验证。

 

  2 结果与分析

 

  2.1 赤霉素对蓝莓种子萌发率的影响

 

  蓝莓品种‘北陆’、‘蓝丰’和‘杜克’的种子用赤霉素浸种20h，在人工气候箱（培养条件见1.2.1）内25d开始出苗，随着培养天数的增加种子萌发率不断增加，本试验选取播种后40d（图1-A）和60d（图1-B）的出苗情况进行比较分析。与对照相比，不同浓度的赤霉素均能提高蓝莓种子的萌发率，40d时（图1-A），‘北陆’在800mg/L浓度下萌发率最高，为69%，‘蓝丰’和‘杜克’均在400mg/L浓度萌发率最高，分别为57%和30%，品种间有差异。萌发率随着播种天数的增加而升高，培养到60d时（图1-B），供试3个品种的萌发率均较40d明显增加，其中‘北陆’在400mg/L浓度下萌发率由40d时的63%增加到88%，而800mg/L浓度下萌发率稍低于400mg/L浓度；对于‘蓝丰’而言，在400mg/L浓度下萌发率较40d时显著增加，由57%增加到87%；杜克60d时也在400mg/L浓度下萌发率达到最高值，为75%，但低于‘北陆’和‘蓝丰’。同时，由图1可以看出，不同的品种对赤霉素浓度的敏感程度有差异，其中‘北陆’种子对赤霉素最敏感，低浓度也能打破休眠，400mg/L赤霉素处理对供试蓝莓种子破休眠和出苗均能达到最佳效果，高浓度稍有抑制。

 

 

  2.2 储藏方式对蓝莓种子萌发率的影响

 

  以2.1确定的400mg/L赤霉素浸种20h为破休眠方式，播种经不同方式储藏的‘北陆’种子，统计40d和60d的萌发率，分析储藏方式对蓝莓种子萌发率的影响。由图2可知，萌发率随着培养时间的延长而增加，其中新鲜种子经赤霉素处理后萌发率最高，60d可高达88%，新鲜种子4℃储藏、自然阴干室温储藏、自然阴干4℃储藏三种方式萌发率基本一致（图2），60d时在78%-80%之间，而-20℃冷冻储藏严重影响种子出苗，其中新鲜种子经-20℃冷冻储藏，40d和60d的萌发率分别为8%和19%，而自然阴干经-20℃冷冻储藏播种，40d和60d的萌发率仅分别为12%和23%。由上述分析可知，新鲜种子经赤霉素浸种破休眠萌发率最高，新鲜种子4℃储藏、自然阴干室温储藏、自然阴干4℃储藏的种子次之，萌发率稍低于新鲜种子，冷冻处理严重损伤种子活性。

 

 

  2.3 播种基质对蓝莓种子萌发率及幼苗生长的影响

 

  以2.1确定的400mg/L赤霉素浸种20h破休眠方式及2.2确定的新鲜‘北陆’种子为试材筛选播种基质，统计40d和60d的萌发率。由图3-A可知，基质类型对蓝莓种子出苗有显著影响，其中以水苔为播种基质萌发率最高，40d和60d分别达到62%和86%，其次是混合营养土和草炭，60d萌发率为分别为50%和52%，细河沙和园土萌发率低，园土萌发率不足水苔萌发率的1/3。

 

  在人工气候箱培养1个月后移至育苗温室，根据蓝莓幼苗的株高度判断基质对蓝莓幼苗生长的影响。由图3-B可知，前3个月幼苗生长缓慢，且各基质处理间无明显差异，第6和第9个月幼苗在不同基质中的长势呈现明显差异，其中在混合营养土中长势最好，第6和第9个月幼苗高度分别为21.2cm和40.1cm，其次是草炭，第6和第9个月幼苗高度分别为13.2cm和27.2cm，幼苗在水苔与草炭中的长势差异不大，而细河沙中长势最差，到第9个月植株平均高度仅10.9cm。

 

  由上述分析可知，水苔是蓝莓种子播种的最佳基质，其次是混合营养土，而蓝莓幼苗在混合营养土中的长势好于水苔。

 

  

  2.4 快速成苗条件优化

 

  根据2.3的结果，水苔是蓝莓种子播种的最佳基质，其次是混合营养土，而蓝莓幼苗生长中后期在混合营养土中的长势好于水苔，故播种容器（带孔泡沫箱）基质优化为分层基质：上层水苔厚6cm，播种后覆盖1cm，下层营养土（草炭：园土：腐熟牛粪/有机肥=2：1：0.1，1-1.5kg 硫磺/ m3）厚5cm，如图4A-B所示；根据2.1和2.2的结果，自然阴干4℃储藏、成熟饱满的蓝莓杂交种子用400mg/L赤霉素浸种20h，2月15日前后在育苗温室播种于上述分层基质中，出苗期间白天温度控制不高于25℃，幼苗生长期间白天温度不高于30℃。2016年-2017年连续2年在育苗温室进行蓝莓杂交种子播种及优化条件验证，与人工气候室相比，在优化的播种条件及温室环境中蓝莓杂交种子出苗时间稍晚于人工气候室，播种后35-40d开始出苗，可能是早春温室晚间温度低于人工气候室所致，但萌发率不受影响（图4-C），其后萌发率不断增加，3个月后进入快速生长期（图4 D-H），9个月后（11月份）进入休眠，株高在40cm-60cm之间（图4-I），次年3月份株移栽（图4-J）。如图4所示，蓝莓杂交种子在上述播种条件下萌发率高且生长健壮。

 

 

  3 讨论

 

  刘燕国等通过研究种子萌发的过程发现，随着种子吸水量的增加，种胚的细胞开始增大，胚被活化，由此诱导赤霉素的形成。当诱导的赤霉素进入胚后诱发各种水解酶的形成并进行生理活动，所以赤霉素作为一种能够打破种子休眠的植物激素。然而不同的种子对赤霉素的敏感度存在差异，破休眠浓度各异，如短尾蓝莓种子在赤霉素浓度1000mg/L条件下发芽率才能达到最高，而乌饭树种子在200mg/L浓度下就能达到与高浓度基本相似的发芽率。本试验发现不同的品种对赤霉素浓度的敏感程度有差异，其中‘北陆’种子对赤霉素最敏感，低浓度也能打破休眠，萌发率较高，‘蓝丰’和‘杜克’对低浓度赤霉素的敏感程度相对较低，可能是对于这两个品种，低浓度的赤霉素不足以诱发种子内水解酶达到最高值，但三个品种均在赤霉素400mg/L浸种20h时种子破休眠和出苗均最高，而高浓度稍有抑制，故确定400mg/L浸种20h是蓝莓种子破休眠最佳处理方式。

 

  休眠是种子对复杂环境的适应特征，受基因型影响，而萌发则受种子成熟度、储藏条件及萌发环境等多因素影响。本试验发现冷冻严重影响种子活性，可能是冷冻过程中种胚受损，而新鲜的蓝莓种子经赤霉素处理即可打破休眠，且萌发率最高，所以杂交种子收获后即刻播种，可实现当年成苗，培育时间缩短一年。但值得注意的是，蓝莓种子从播种到小苗休眠需要至少6-7个月的时间才能保证枝条成熟，如6-7月收获种子且无温室加温条件，新鲜种子播种会导致幼苗生长量不足、枝条不成熟而无法安全越冬，所以这种情况下不建议新鲜种子立即播种。此外，本实验发现新鲜种子4℃储藏、自然阴干室温储藏、自然阴干4℃储藏三种方式种子萌发率在78%-80%之间，稍低于现取新鲜种子，但需要说明的是，如新鲜种子中混杂果柄、果皮等杂质，经4℃长期储藏（湿度80%，密封）后会发生霉变，导致种子受霉菌污染，储藏存在风险。基于上述分析，如无冬季加温温室条件，建议蓝莓杂交种子自然阴干后室温或4℃储藏，次年春季播种。

 

  对于播种基质，丁亦男 等发现蓝莓种子萌发对氧气敏感，透气性与种子萌发率呈正比，此外，经本实验室多年摸索发现播种基质是种子萌发的最重要条件之一，且蓝莓种子萌发及后期生长过程中喜湿怕涝，所以，蓝莓播种基质的透气性和持水性是关键。从本试验结果可知水苔播种后萌发率最高，可能的原因是水苔疏松透气、自身持水性强，对高温有缓冲，基质温度变化缓慢，不会骤降骤升，即便在正午高温时也不会因水苔温度骤升而导致幼苗或根系受损，且有一定的蓄热性，夜间温度高于其他基质，有利于种子萌发和根系生长；相比之下，河沙做基质，虽有很好的透气性，但持水性差，正午高温时基质水分蒸发快且基质温度迅速升高，种子、幼苗及根系极易因高温伤害和缺水而死亡，不适合做蓝莓种子播种基质；而园土透气性差，浇水后易板结，此外，草炭虽疏松透气，但持水性较差，表层易干，需勤浇水或喷水，管理不当刚萌发的幼苗易缺水死亡，故均不适合做蓝莓种子播种基质。此外，刘肖等使用400 mg/L赤霉素浸泡蓝莓杂交种子24 h后播种于腐殖土+苔藓+松针体积比例为 1：1：1的基质中，种子发芽率为41%，而本试验采用了与其相似的破休眠处理播种于水苔中，种子萌发率为86%，明显高于刘肖等[3]。综上，水苔是最适合蓝莓种子播种的基质。

 

  播种基质不仅影响播种的萌发率，与后期生长密切相关，而现有报道尚未涉及。本试验发现蓝莓幼苗到生长后期混合营养土（草炭：园土：腐熟牛粪/有机肥=2：1：0.1，1-1.5kg 硫磺/ m3）中长势最好，到休眠时植株高度可达到31.2-60.3cm，平均为40.1 cm。相比之下，蓝莓种子虽在水苔中萌发率最高，但生长后期幼苗生长缓慢，叶色发黄，主要原因是水苔本身不能提供植物生长所需的养分和酸性环境，导致叶片出现缺铁性失绿现象，而混合营养土中养分充足，可供给植物后期的快速生长，且为根系创造了酸性条件，利于根系生长和对铁元素的吸收。所以，将基质优化为上层水苔下层混合营养土，既能给种子萌发创造最佳环境又能确保幼苗快速生长的营养和根系生长的酸性环境。

 

  4 结论

 

  如上所述，蓝莓种子用400mg/L赤霉素浸种20h破休眠效果最佳；新鲜种子萌发率最高但需根据种子采收时间和育种温室条件规划播种，自然阴干蓝莓种子萌发率稍低于新鲜种子，不建议对种子进行冷冻处理；经优化蓝莓种子播种于上层水苔下层营养土（草炭：园土：腐熟牛粪/有机肥=2：1：0.1,1-1.5kg 硫磺/ m3）的分层基质中，既能满足初期种子萌发对氧气、水分和温度的需要，又能保证生长中后期对养分的需求，35d-40d后陆续出苗，且萌发率高、成苗快，操作性强，管理方便，出苗期间白天温度不高于25℃，夜间温度不低于15℃，幼苗生长期间白天温度不高于30℃。