酿酒微生物岗位

刘延琳

  葡萄酒香气是影响葡萄酒质量的最重要的方面之一。葡萄酒中的香气成分包括几百种不同的化合物，浓度在0.1 µg/L到100 mg/L之间（Ebeler和Thorngate, 2009）。葡萄酒的香气被分为三类：源于葡萄的挥发性化合物（品种香气或一级香气）、酵母和细菌代谢（发酵香气或二级香气）以及发酵后的陈酿过程（陈酿香气或三级香气）。品种香气的前体物质在葡萄果实的外果皮中产生，其在葡萄酒中的最终浓度主要受葡萄品种的影响，其次受成熟度、栽培方式和酿造技术的影响。一方面，葡萄衍生的香气化合物在相应的葡萄酒中对独特香气属性的表达起着关键作用。另一方面，在酒精发酵过程中，葡萄酒的酿酒酵母（包括非酿酒酵母）能够通过次级代谢的不同途径影响葡萄酒发酵香气，但它们也会通过特定的酶活性影响品种香气前体物质的化学性质。

  1.品种香气

  1.1 C6化合物

  葡萄酒中的C6化合物包括醇类和醛类，是植物重要代谢产物，约占葡萄酒品种香气的70%，它们通过脂氧酶途径从膜脂中提取。首先，亚油酸和α-亚麻酸在酰基水解酶的作用下产生，然后在有氧条件下通过脂氧酶的作用下形成相应的13-氢过氧化物，然后在氢过氧化物酶作用下亚油酸的氢过氧化物生成己醛，α-亚麻酸的氢过氧化物生成反式-3-己烯-1-醛和顺式-2-己烯-1-醛；异构酶可以将这两种己烯醛相互转化。最后，醇脱氢酶可将醛还原成相应的醇，即1-己醇、顺式-3-己烯-1-醇和反式-3-己烯-1-醇（Robinson, 2014）。其中顺式-3-己烯-1-醇及其异构体反式-3-己烯-1-醇的含量是鉴别雷司令（Riesling）、穆勒-图尔高（Müller-Thurgau）、克尔纳（Kerner）、舍雷伯（Scheurebe）、埃赫伦费尔斯（Ehrenfelser）和巴克斯（Bacchus）等单品种葡萄酒最重要的分析参数。这两种化合物含量比较稳定，并且不受酵母菌代谢活动的影响（Oliveira, 2006）。

  1.2 萜烯类化合物

  花果香是葡萄酒中重要的挥发性香气物质，而萜烯类化合物是赋予葡萄酒花香和果香的主要成分之一。萜烯类化合物是由多个异戊二烯（isoprene, C5）结构构成，葡萄酒中主要的萜烯类化合物主要是单萜（monoterpene, C10）和倍半萜（sesquiterpene, C15）及其衍生物。在葡萄果实中萜烯类化合物前体物质的生物合成途径有两条，甲羟戊酸途径（MVA pathway）和甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP pathway）（Yu & Utsumi，2009）。葡萄酒中的萜烯类化合物都始于葡萄果实中共同的前体物质：异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate, IPP）或其异构体二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP），在相应酶的作用下合成牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate, GPP）、法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate, FPP）和牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate, GGPP），再通过相应合成酶的作用合成糖苷前体物质（图1）。

  单萜是葡萄酒萜烯类香气物质中含量最高、种类最丰富的化合物，已经在葡萄酒中发现了大约50种单萜类化合物，其中有几种有助于形成花香或柑橘的香气轮廓。葡萄酒中的单萜化合物主要是由葡萄果实中形成的非挥发性的单萜二糖苷在酿造过程中通过酸解或糖苷酶（葡萄糖苷酶、鼠李糖苷酶、木糖苷酶等）水解形成（Williams, 1993）。酿酒葡萄中最常见的单萜是里那醇（linalool）、香叶醇（geraniol）、香茅醇（citronellol）、橙花醇（nerol）、α-萜品醇（α-terpineol）等（图2），气味阈值介于0.087 μg/L（里那醇）到350 μg/L（α-萜品醇）之间（Guth, 1997）。单萜是芳香型葡萄酒（如慕斯卡托、琼瑶浆）中最重要的品种香气，但在非芳香型葡萄酒中单萜对品种香气的贡献较少，主要是C-13降异戊二烯类来贡献品种香气。

  倍半萜相比于单萜在葡萄酒中含量较少，并且倍半萜挥发性更少和芳香活性低，目前在葡萄酒中的研究有限（May and Wüst, 2012）。研究表明，葡萄果实中倍半萜在外果皮中形成并积累，而单萜主要在中果皮中发现（May et al. 2013）。大多数倍半萜赋予葡萄酒花香的香气轮廓，少数赋予葡萄酒柑橘类水果香气。葡萄酒中常见的倍半萜有莎草奥酮（Rotundone）、橙花叔醇（Nerolidol）、(E)-β-丁香烯（(E)-β-Caryophyllene）等（图2）。其中莎草奥酮是目前研究最多的倍半萜，赋予葡萄酒黑胡椒的香气。Wood等（2008）采用GC-MS-O以d5-莎草奥酮为内标首次确认了在西拉葡萄酒中黑胡椒香气来源于莎草奥酮。

  1.3 C13-去甲类异戊二烯

  C13-去甲类异戊二烯类化合物是葡萄酒品种香气之一，是葡萄果实中的次生代谢产物，C13-去甲类异戊二烯类化合物的丰度受多种因素影响（Feng et al., 2015）。无论红、白葡萄或中性、芳香性葡萄都含有C13-去甲类异戊二烯，具有花香、果香、汽油味和草药味等香气特征。研究发现C13-去甲类异戊二烯提供的红色水果香气会获得葡萄酒专家较高的质量评级（Sáenz-Navajas et al., 2015），尤其是非芳香品种（如赤霞珠、西拉、长相思和黑比诺等）挥发性化合物的重要组成成分。

  C13-去甲类异戊二烯类化合物是类胡萝卜素的生物降解产物。类胡萝卜素的生物合成在叶绿体中进行，从所有萜类化合物的共同前体异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate, IPP）开始，经过几个步骤合成（Baumes et al., 2002）。类胡萝卜素以纯碳氢化合物形式（如β-胡萝卜素）或含氧形式存在。最初提出类胡萝卜素可以通过化学、光化学和氧化酶耦合机制进行降解，但最近的研究支持了一种区域特异性氧合酶（CCD）参与C13-去甲类异戊二烯形成的假说（Lashbrooke et al., 2013）。与花香或果香相关的C13-去甲类异戊二烯类化合物，构成了非花香葡萄挥发性化合物的重要组成部分（Ilc et al., 2016）。据报道，在葡萄酒中，主要有四种C13-去甲类异戊二烯类化合物，即β-大马酮、β-紫罗兰酮、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘（R12N）和(E)-1-(2,3,6-三甲基苯基)丁-1,3-二烯（TPB）（图3）。对于其余绝大多数C13-去甲类异戊二烯类化合物，尚未进行感官阈值研究，因此它们对香气的影响目前尚不清楚。

  1.2 发酵香气

  1.2.1 高级醇

  高级醇是葡萄酒中含量最高的挥发性香气化合物，在酒精发酵过程中由氨基酸转化产生（图4）。氨基酸分解为高级醇的过程称为Ehrlich反应，Ehrlich反应还直接或间接地影响其他香气化合物的合成（Hazelwood et al., 2008）。除了三种非极性支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）外，其他氨基酸也可以通过该反应分解为其他代谢物。然而，最重要的气味相关产物（高级醇和挥发性脂肪酸）是由缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸产生的。高级醇由侧链中含有两个以上碳原子的醇类组成，因此沸点比乙醇高（Lilly et al., 2006）。

  高级醇是葡萄酒中含量最高的香气化合物，通常赋予葡萄酒杂醇味、生青味等特征，低浓度（<300 mg/L）的高级醇可以增加葡萄酒中香气复杂度，但高于400 mg/L的高级醇会给葡萄酒带来不良风味（Rapp & Mandery, 1986）。通常在葡萄酒中发现的浓度相对较高的高级醇包括1-丙醇、1-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇和苯乙醇（Lachenmeier et al., 2008）。

  1.2.2 酯类化合物

  酯类化合物在合成过程中由多种酶催化，乙酸酯的形成由醇类乙酰转移酶(Atf1p和Atf2p)、异戊醇乙酰转移酶和乙醇乙酰转移酶催化（Lily et al., 2000），而乙基酯的形成则是由两种酰基-CoA:乙醇O-乙酰转移酶(Eeb1p和Eht1p)催化（Saerens et al., 2008）。乙醇脱氢酶氧化半缩醛化合物（由醇和醛混合物形成）形成酯类物质（Park et al., 2009）。研究表明，葡萄酒中的酯类化合物主要是由酵母代谢产生的，不同的酵母菌株之间酯类的形成有很大的不同，其他的外部因素如发酵温度、营养物质、pH值、不饱和脂肪酸、甾醇水平和氧气水平都对葡萄酒中酯类物质的最终含量起着重要作用（Lee et al., 2004）。

  葡萄酒中的发酵产生的次级风味主要来源于活性酯类，酯类化合物是葡萄酒中种类最丰富的化合物。酯类化合物具有较低的香气阈值，目前鉴定出约160种，主要赋予葡萄酒浓郁的果香和花香，对葡萄酒香气的浓郁度和持久性具有重要影响（Tao et al., 2008）。但是当葡萄酒中含量高于200 mg/L时，则会掩盖品种香气的表现能力（Belda et al. 2017）。

  1.2.3 挥发性脂肪酸

  挥发性脂肪酸也有助于葡萄酒的风味和香气。在酵母发酵过程中，中链和长链脂肪酸是通过脂肪酸合成途径由乙酰-CoA形成的，乙酰-CoA是脂肪酸代谢的中间代谢物（Nykanin, 1986）。通常认为中链脂肪酸是对酵母细胞有毒性的，会延缓葡萄酒发酵，但研究表明葡萄酒高含量的中链脂肪酸并不是导致发酵停滞的诱因（Bardi et al., 1999）。