蓝莓沈阳综合试验站

 

  1.主要研究内容

 

  （1）采用pH示差法比较4个品种花色苷含量的差异，筛选高花色苷含量基因型材料。

 

  （2）蓝莓花色苷的提取：分别采用溶剂法、酶法提取技术对蓝莓花色苷进行提取，找出最佳提取方法及提取条件，并对2种提取方法进行比较。

 

  （3）蓝莓花色苷分离纯化的研究：通过测定10种大孔树脂对花色苷吸附率和解吸率的测定，确最佳树脂，然后考察一些因素对静态吸附解吸和动态吸定附解吸的影响，用聚酰胺、硅胶等介质对蓝莓花色苷进一步纯化，提高色价。

 

  （4）蓝莓花色苷理化性质的研究：研究温度、pH值、光、微波、金属离子、氧化剂、还原剂、食品添加剂等对蓝莓花色苷稳定性的影响。

 

  （5）蓝莓花色苷的组成和结构分析：对蓝莓花色苷进行紫外—可见光谱分析。通过高效液相色谱—质谱联用技术确定单体的组成和分子量。通过制备型高效液相色谱对蓝莓花色苷单体进行分离，通过紫外、红外、质谱、核磁共振确定蓝莓花色苷的结构。

 

  （6）蓝莓花色苷中糖的组成研究

 

  （7）蓝莓花色苷稳定性研究：利用有机酸对蓝莓花色苷进行分子修饰，采用不同的壁材对蓝莓花色苷进行微胶囊化。

 

  （8）蓝莓花色苷抗氧化的研究：研究蓝莓花色苷对猪油和脂质过氧化的抑制作用、还原能力；对羟基自由基、超氧阴离子、DPPH自由基和H2O2的清除能力。

 

  （9）将高活性微胶囊化后的花色苷应用于蓝莓深加工产品。

 

  2.主要技术攻关内容

 

  2.1 确定高花色苷含量蓝莓品种

 

  对适合沈阳地区生长的蓝莓品种进行花色苷含量测定，其中蓝莓主要品种有：达柔（darrow）、北极星(polaris)、早蓝(earliblue)、北陆(northlannd)、伯克利(berkeley)、耐尔森(nelson)、公爵(duke)。利用PH示差法对上诉各个蓝莓品种进行花色苷含量测定，挑选出花色苷含量高的蓝莓品种1-2个。其测定结果如下：

 

 

  由以上结果可知：蓝莓公爵花色苷含量最高，高达426mg/100g鲜果。非常适合进行花色苷提取。

 

  2.2 确定花色苷提取方法及条件

 

  花色苷的提取方法国内外许多学者做了大量研究，提取方法主要有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法和酶法等。利于上诉4种方法进行比较分析，选择一种高效、可行的提取方法。具体实施如下：

 

  溶剂萃取法：

 

  （1）提取溶剂的选择

 

  配制几种提取剂（蒸馏水、1%柠檬酸、0.37%盐酸、70%乙醇+柠檬酸溶液、70%乙醇+盐酸溶液、70%甲醇+盐酸溶液），在温度45℃，料液比1g:30mL，浸提60min，PH示差法测定花色苷吸光度值，筛选出合适的溶剂。

 

 

  用70%乙醇+柠檬酸、70%乙醇+盐酸、70%甲醇+盐酸提取与用去离子水、1%柠檬酸、0.37%盐酸相比花色苷吸光度差异显著（P＜0.05），/70%乙醇+柠檬酸、70%乙醇+盐酸、70%甲醇+盐酸提取，三者花色苷吸光度差异不显著，考虑甲醇具有毒性，可以用70%乙醇+柠檬酸或70%乙醇+盐酸对蓝莓花色苷进行提取。

 

  （2）确定最佳工艺条件的正交试验

 

  在单因素试验的基础上，选择料液比、乙醇浓度、提取时间、提取液pH值进行4因素3水平正交实验设计，采用L9(34)正交表进行试验，确定最佳工艺参数。以提取液中花色苷含量为考察指标，花色苷含量以吸光度表示。

 

  溶剂法提取蓝莓花色苷最佳条件为65％乙醇，料液比为1g:20mL，提取时间150min，pH3.0、提取温度45℃，提取2次即可。提取量比水提高出近50%。

 

  酶法提取：

 

  用柠檬酸和柠檬酸钠以一定比例混合调pH值，CK（不加酶），a（0.08%果胶酶），A（0.08%纤维素酶），a+A（0.08%果胶酶+0.08纤维素酶），温度45℃，料液比1g:20mL，酶解时间90min，酶解后2000r/min离心20min，测定花色苷含量。处理结果如下：

 

 

  一定量的纤维素酶使蓝莓花色苷提取量提高，果胶酶未使花色苷提取量提高。两种酶复合处理花色苷提取量略低于相同用量的纤维素酶花色苷提取量，两种酶无协同作用。

所以选用纤维素酶提取蓝莓花色苷。

 

  （3）酶解反应条件的优化

 

  根据单因素试验结果，纤维素酶的最适pH值为5.0，在此条件下，选择酶用量、料液比、酶解时间、酶解温度为考察因素，按正交表对酶法提取工艺进行研究，确定蓝莓花色苷酶法提取的最佳工艺参数。处理结果如下：

 

  纤维素酶提取蓝莓花色苷最佳条件为酶用量0.1%，料液比1g:12mL，酶解时间90min，pH5.0，酶解温度为45℃，提取2次即可。

 

  超声波辅助提取：

 

  根据单因素试验结果，提取溶剂采用0.1%HCl的65%乙醇溶液，在此条件下，选择超声波功率、提取时间时间、温度为考察因素，按L9（34）正交表对超声波提取工艺进行研究，确定蓝莓花色苷超声波提取的最佳工艺参数。

 

  采用0.1%HCl的65%乙醇溶液的同时，辅助功率200W超声波，时间为60min，提取温度为50℃，超声波法和溶剂浸提法的提取率分别为87%，80%，提取率提高了7%。

 

  超临界CO2萃取：

 

  以蓝莓为原料, 利用正交试验优化超临界CO2萃取蓝莓花色苷的工艺。在单因素试验基础上,以萃取压力、萃取温度、萃取时间和液料比为影响因素,进行四因素三水平试验。试验结果如下：

 

  确定萃取的最佳工艺条件是萃取时间75min,萃取温度45℃,萃取压力28 MPa,液料比为10:1(mL:g)，花色苷提取率为91% 。

 

  对四中方法进行比较，以花色苷提取率为指标，结果如下：

 

  根据实验结果在结合实际生产分析：（1）超临界CO2萃取蓝莓花色苷提取率最高，并且超临界流体萃取无化学试剂残留和污染，并可避免萃取物在高温下分解，保护生理活性物质的活性及保护萃取物的天然风味。但是结合目前超临界萃取技术设备昂贵，生产量小，效率不高，不适合进行大规模生产。（2）在用酸性乙醇提取的同时辅助超声波，提取率相对酸性乙醇浸提法并没有显著提高，可能是酸性乙醇本身提取效果很好，掩盖了超声波的作用或者超声波的功率低，超声波的作用没有显现出来。（3）酶法相对水提法蓝莓花色苷的提取量提高50%，酶法与醇提相比，蓝莓花色苷提取量提高量也不大，但酶用量少，不用回收试剂，降低成本，容易实现绿色生产。但是，乙醇提取提取液乙醇沸点低，容易进行浓缩回收，成本较低。

 

  综合分析：比较溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法和酶法，酶法和溶剂乙醇萃取法是较为理想的提取方法。

 

  2.3 花色苷纯化技术分析

 

  经萃取后浓缩或干燥方法生产的蓝莓花色苷还是粗制品，其中含有淀粉、糖类、脂肪、有机酸碱、无机盐、胶体、金属离子等，这直接影响它的稳定性和着色力，是影响色素推广应用的主要原因之一。因此，花色苷类色素的纯化是生产加工中的一个重要环节，可以采用的方法有吸附解析法、膜分离法、高效液相色谱法等。

 

  本项目通过测定10种树脂对花色苷吸附、解析效果的测定，选择最佳树脂，然后优化树脂纯化条件，再用聚酰胺、硅胶介质对花色苷提取物进一步纯化，提高色价和纯度。

 

  不同大孔树脂对蓝莓花色苷的吸附和解吸试验

 

  准确称取预处理大孔树脂若干份，每份2.0g，置于100mL三角瓶中。量取一定量蓝莓花色苷粗提物，用pH3.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释，520nm下测其吸光值A0。然后取其50mL分别加入到盛有2.0g树脂的三角瓶中，置恒温振荡器上30℃、110r/min振荡24h，充分吸附后，过滤，测滤液的吸光值A1；将滤出的树脂加入到50mL、pH3.0 60%乙醇溶液中，置振荡器上于30℃、110 r/min下振荡24h，充分解吸后过滤，测滤液的吸光值A2，计算吸附率α和解吸率β。

 

 

  经分析：AB-8、XAD-7、NKA-2、X-5这四种大孔树脂纯化蓝莓花色苷效果较好，其中NKA-2综合效果最好，适合使用推广。

 

  对NKA-2大孔树脂纯化条件进行优化得出：

 

  NKA-2大孔树脂对花色苷的吸附属多分子层吸附，吸附平衡时间为4.5h，解吸平衡时间为2.5h，吸附平衡最适质量浓度为860mg/L，在30℃，pH3.0时吸附能力比较强,用pH3.0的55%乙醇溶液作为解吸液。

 

  蓝莓花色苷在NKA-2树脂上的动态最佳吸附解吸条件为吸附流速为1.5mL/min，上样液浓度为5.0mg/mL，用7倍柱床体积的55%酸性乙醇作为洗脱液,洗脱流速为1.5mL/min。

 

  NKA-2树脂重复使用性能较好，重复使用5次后，吸附率只降低了3.12%。

 

  2.4 提取物成分分析

 

  （1）花色苷含量分析

 

  花色苷作为目标物是含量分析的重点，选择PH示差法和高效液相色谱法同时进行测定，测定结果为：PH示差法测定花色苷含量为25.8%:和高效液相色谱法24.2%。

 

  （2）多酚化合物含量分析

 

  多酚化合物利用福林-酚法测定含量，结果为：55.4%。由于目标物花色苷属于多酚类化合物，所以多酚类化合物中31.2%属于杂质。

 

  （3）糖类化合物含量分析

 

  糖类化合物含量分析时为了提高灵敏度采用蒽酮-硫酸法，测定结果为：14.6%，其中多糖占4.8%，单糖和低聚糖占10.2%。

 

  （4）蛋白质含量分析

 

  蛋白质含量分析时为了提高灵敏度采用考马斯亮蓝法，测定结果为：13.1%。

 

  （5）有机酸含量分析

 

  有机酸含量分析为了提高准确性采用高效液相色谱法，测定结果为：7.7%。

 

  （6）脂类化合物含量分析

 

  脂类化合物含量分析采用索氏提取法，测定结果为：2.7%。

 

  由于试验条件限制，其余6.1%成分可能含有无机盐等，未做分析。

 

  2.5 纯化工艺优化

 

  根据1.2.5试验结果对纯化工艺进一步优化；利用乙酸乙酯萃取提取物，以出去脂类化合物；利用醇沉法出去多糖和蛋白质化合物。使提取物含量进一步提高。

 

  2.6 硅胶柱法纯化花色苷提取物

 

  首先利用硅胶薄层层析分离蓝莓花色苷，为硅胶柱法纯化花色苷提取物可行性提供依据及提供必要的分离条件。

 

  （1）硅胶薄层层析分离蓝莓花色苷

 

  由图3-19可以看出，正丁醇-乙酸-水（4:1:5）为展开剂适于蓝莓花色苷的分离，此条件下分离出的清晰斑点数比较多，分开距离适中，且原点处颜色较浅，说明花色苷组分已基本跑出。以乙酸乙脂-甲酸-水（10:2:3）为展开剂分离出清晰斑点3个。以水-乙醇-正丁醇-乙酸乙脂（12:8:24:36）为展开剂也分离出清晰斑点4个，但略拖尾。以乙酸乙脂-乙酸-盐酸-丙酮（5:5:2:1）为展开剂花色苷未发生分离。说明展开剂中加酸利于抑制斑点的拖尾现象，从而改善层析效果。

 

 

 

 

  根据上述实验结果可知：利用硅胶柱进行纯化花色苷可行，利用乙酸乙脂-甲酸-水（10:2:3）为展开剂效果较好。

 

  （2）硅胶柱层析纯化蓝莓花色苷

 

  用硅胶柱层析纯化花色苷，其色价进一步提高，为79.20，回收率为69.40%。

 

  2.7 蓝莓花色苷单体分离技术

 

  花色苷单体分离技术目前主要有：采纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、高速逆流色谱、高效液相色谱等多种技术，但其都存在成本高、效率低等问题。

 

  采取动态轴向压缩技术（DAC）是当今制备色谱领域最佳的装柱技术，先进DAC动态轴向压缩制备柱系统能自行装柱、维持柱压、自行卸柱，兼有色谱柱和装柱机的功能，采用DAC装填的色谱柱完全满足床层的连续性、均匀性、稳定性和紧密性等要求。不同直径的动态轴向压缩制备柱系统分离效果与分析柱分离效果相当。

 

  （1）将含25%蓝莓花色苷醇提物粉末用17%甲醇溶解后，5000r/min离心10min；然后用0.45um有机相滤膜过滤，花色苷醇提物含量为40g/L，得花色苷上样液；

 

  （2）花色苷上样液在中压色谱柱上，经分离程序1分离，按照时间顺序得到了5个组分，5个组分分别经45℃真空浓缩，真空冷冻干燥，得5个花色苷初制备样。

 

  分离程序1中的流动相分别为A相：色谱纯，100%甲醇；B相：2.5%甲酸的纯水；流动相的洗脱条件是：0-26min，17%A相，83%B相；26-31min，17%-22%A相，83%-78%B相；31-46min，22%-27%A相，78%-73%B相；46-55min，27%-30%A相，73%-70%B相；55-64min，30%A相，70%B相；64-90min，30%-50%A相，70%-50%B相，90-130min，50%A相，50%B相。

 

  （3）将花色苷初制备样分别用17%甲醇溶解后，5000r/min离心10min；然后用0.45um有机相滤膜过滤，花色苷初制备样含量为40g/L；得花色苷初制备样溶液；

 

  （4）花色苷初制备样溶液在高压色谱柱上，经分离程序2分离，按照峰形直接截取目标峰得12种花色苷单体，12种单体溶液分别经45℃真空浓缩，真空冷冻干燥，得12中花色苷单体干粉，纯度都大于等于95%。

 

  分离程序2中的流动相分别为A相：色谱纯，100%甲醇；B相：2.5%甲酸的纯水；流动相的洗脱条件是：0-20min，18%A相，82%B相；20-42min，18%-27%A相，82%-73%B相；42-52min，27%-30%A相，73%-70%B相；52-62min，30%A相，70%B相；62-112min，30%-50%A相，70%-50%B相；112-150min，50%A相，50%B相。

 

  2.8 蓝莓花色苷理化性质及其稳定性主要研究结果

 

  蓝莓花色苷属于水溶性色素。该花色苷在pH小于3.0条件下比较稳定，在60℃以下热稳定性较好，在短时间内有一定的耐高温能力。对光比较敏感，微波对其稳定性无不良影响。该花色苷耐氧化还原性差，抗坏血酸使花色苷稳定性下降，加速花色苷溶液的褪色。蔗糖和葡萄糖对蓝莓花色苷稳定性均无不良影响，高浓度的蔗糖和葡萄糖对其有不同程度的护色效果。苯钾酸钠对蓝莓花色苷稳定性具有良好作用。K+不能使花色苷的吸光度增加，对花色苷的稳定性也无明显影响；Mg2+、Ca2+、Cu2+、Al3+具有增色作用，对花色苷的稳定性无显著影响；高浓度Na+、Zn2+、Mn2+具有增色作用，而且能够增强花色苷的稳定性；Fe2+ 、Fe3+、Pb2+对花色苷具有破坏作用，使花色苷的稳定性下降，含Fe3+、Pb2+的花色苷溶液出现浑浊，有沉淀生成。

 

  2.9 蓝莓花色苷组成

 

  蓝莓中主要含有12种花色苷，按试验条件的出峰顺序依次为飞燕草色素-3-半乳糖苷、飞燕草色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-葡萄糖苷、牵牛花色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素-3-阿拉伯糖苷、牵牛花色素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖苷，其中锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷两种花色苷为蓝莓中的主要花色苷。蓝莓花色苷中主要含半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖。

 

  2.10 蓝莓花色苷对氧化剂清除能力

 

  （1）蓝莓花色苷具有抗油脂氧化能力，但抗油脂氧化能力不如BHT，蓝莓花色苷具有抗脂质体过氧化能力，并且明显优于抗坏血酸。

 

  （2）蓝莓花色苷具有清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和H2O2能力。蓝莓花色苷对OH·清除率高于抗坏血酸。

 

  （3）蓝莓花色苷清除DPPH自由基能力略好于抗坏血酸，蓝莓花色苷对H2O2的清除能力低于抗坏血酸。

 

  2.11 蓝莓花色苷微胶囊化

 

  以麦芽糊精和阿拉伯胶为复合壁材的微胶囊化最佳工艺参数为：麦芽糊精与阿拉伯胶比为2:1，研磨时间为50 min，芯壁比为1:15，壁材浓度为50 %，在此最佳条件下得到最佳的包埋效果，包埋率为97.75%，电镜下观察微胶囊呈方形或不规则形状，表面光滑，致密性好，无明显裂痕；以β-环糊精为壁材的微胶囊最佳工艺条件为：芯壁比为1: 6，β-环糊精浓度为80 %，研磨时间为40 min，在此最佳条件下得到蓝莓花色苷微胶囊的包埋率为80.57%，电镜下观察微胶囊表面粗糙，有裂痕，但连续性较好；以乙基纤维素为壁材的蓝莓花色苷微胶囊最佳工艺条件为：芯壁比为1:15，乙基纤维素浓度为2.0%，研磨时间为60min，聚乙二醇浓度20%，在此条件下得到蓝莓花色苷微胶囊包埋率为68.83%，电镜下微胶囊表面粗糙而且有明显裂痕，连续性和完整性比较差。

 

  与未被包埋的蓝莓花色苷相比，经过微胶囊化以后的蓝莓花色苷缓释效果明显，提高了对光和热的稳定性。其中以阿拉伯胶、麦芽糊精为复合壁材的微胶囊化树莓花色苷的稳定性最好，其次是以β-环糊精为壁材的蓝莓花色苷微胶囊。

 

  2.12 蓝莓花色苷分子修饰

 

  利用有机酸对花色苷分子进行酶促酰化处理，得到了稳定的衍生物。利用紫外和红外图谱扫描衍生物的初步结构，观察特征吸收波长产生的特征峰，与未转化样品进行对比证明酰化成功。

 

  为了考察酰化衍生物的稳定性，采用分光光度法对蓝莓花色苷及其衍生物关于时间、光照、温度、金属离子、氧化剂、还原剂、糖类和食品添加剂的影响实验得出：衍生物的稳定性远远优于未转化样品。但蓝莓花色苷衍生物安全性还需进一步进行验证。