无核种质材料创制岗位

王富强 刘国甜 王跃进 张朝红 徐炎

  本技术使用85份葡萄品种（其中无核品种55份，有核品种30份），分别于2021年8月采自中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州葡萄圃（43份）和西北农林科技大学园艺场葡萄资源圃（42份）。‘红地球’和‘黎明无核’及其60份杂交F1代单株于2019年6月采自中国农业科学院郑州果树研究所尉氏基地，‘SP522’和‘火焰无核’及其17份杂交F1代单株于2021年10月采自新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所试验场。

  引物设计：从Ensemblplants网站下载葡萄参考基因组（PN40024）的18号染色体的DNA序列（https://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Gene），设计VviAGL11-KASP标记的引物（引物Fa加有FAM荧光标签，特异识别A碱基；引物Fb加有HEX荧光标签，特异识别C碱基）以及用于扩增突变位点前后的基因序列的引物。基因组DNA提取：将采集的所有样品分别研磨成粉末并加入裂解液（2% CTAB、2% PVP40、1% β-ME、200 mM NaCl、0.2 mM EDTA pH 8.0和50 mM Tris pH 8.0），65℃孵育30 min，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比为24：1），16000 g离心15 min，抽提两次，取上清后使用无水乙醇过夜沉淀。沉淀使用70%乙醇洗两遍，吹干后使用50 μL TE缓冲液完全溶解，用分光光度计检测DNA含量和质量。KASP-PCR反应：KASP引物混合物（KASP Primer mix）配置：首先将KASP引物的3条引物干粉用TE（pH 8.0）溶解至50 μmol·μL-1，然后按照上游分型引物1、上游分型引物2、下游通用引物按照1:1:3的比例混合。KASP-PCR反应体系为10 μL，包含：2 µL模板DNA、0.125µL KASP Primer mix和5 µL 2×KASP Master mixture，补水至10 µL。其中，KASP Master mixture为FLU-ARMS for KASP 2X PCR mix，sto ROX。KASP-PCR反应程序：（1）94℃预变性15 min；（2）94℃变性20 s；61~55℃退火延伸60 s，10个循环（每个循环降低 0.6℃）；（3）94℃变性20 s；55℃退火延伸60 s，26个循环；（4）37℃荧光读取1 min。前三个阶段在PCR仪ABI 9800上进行，荧光读取在ABI 7900。

  根据FAM、HEX两种不同荧光的峰值大小，绘制聚类图，判定对应样品的基因型。通过基因分型检测，若该位点基因型为C：C，葡萄种子表现为有核，若该位点的基因型为A：C，葡萄种子表现为无核。结果显示VviAGL11-KASP具有较好的分型效果。其中，30份有核品种均能有效区分，6份多倍体无核品种中‘夏黑’、‘烟葡1号’、‘月光无核’、‘瑞峰无核’四个品种区分不开，49份二倍体无核品种中除了‘科玉无籽’、‘无核白鸡心’两个品种，其余品种均可区分。VviAGL11-KASP标记在77份二倍体品种中可以区分75份品种，准确率为97.4%。在‘红地球’和‘黎明无核’60份杂交后代使用VviAGL11-KASP标记区分有核和无核的准确率为100%。在‘SP522’和‘火焰无核’杂交后代中，17份株系有核和无核性状的准确率为100%。开发新的VviAGL11-KASP标记可以准确用于葡萄无核性状分子标记辅助育种选择，提高无核育种效率。