病毒病防控岗位
胡国君 董雅凤 张尊平 范旭东 任芳
葡萄（Vitis spp.）主要通过无性方式进行繁殖，这种繁殖方式使得葡萄体内的病毒等细胞内专性寄生物在各葡萄产区广泛传播，给葡萄产业带来严重危害。葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus, GFkV）和沙地葡萄茎痘病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV）是2种侵染率高，且难以脱除的葡萄病毒。为了提高GFkV和GRSPaV的脱毒效率，本研究比较了单独化学处理、单独热处理、化学处理结合热处理的脱毒效果。研究结果表明，化学处理结合热处理可有效提高脱毒率。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验室保存的来源于中国农业科学院果树研究所的‘87-1’葡萄试管苗，样品经RT-PCR检测携带GFkV和GRSPaV。
1.2 方法
含病毒醚的MS培养基的配置：先配制浓度为1,000 μg/mL病毒醚溶液，然后将母液加入到经高温灭菌且冷却至60-70 °C的MS培养基中，使其终浓度为15 μg/mL和25 μg/mL，加完后迅速混匀，然后置于室温条件下备用。
离体植株的继代培养：葡萄试管苗一般培养40-50d后需进行继代，每次继代切取1.5-2cm左右的茎尖或茎段转到新鲜的MS基本扩繁培养基中，每次继代的离体材料需抽样进行RT-PCR检测，以便确保带毒。当离体材料扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取1 cm的茎尖进行脱毒处理。
总RNA的提取：称取0.1 g样品，液氮研磨，加入0.5 ml提取缓冲液，充分震荡混匀；向匀浆液中加入25 μL 20% SDS混匀，65 °C 20 min；加入125 μL 5 M KOAc，震荡混匀后冰上放置20 min，4 °C，12,000 g离心15 min；吸上述上清液400 μL加入2倍体积的无水乙醇，冰上放置10 min后，4 °C，1,2000 g离心10 min；沉淀用75%乙醇洗涤两次，加入50 μLDEPC处理的去离子水。
RT-PCR检测：取上述总RNA和M-MLV进行cDNA的合成。取上述cDNA 进行PCR扩增，同源和互补引物参照表1。
荧光定量PCR检测：利用去基因组DNA试剂盒进行反转录，然后用SYBR染料进行定量PCR扩增，实验操作参照试剂盒说明书。 将Cq > 35的检测样品作为阴性对照，每个样品三次重复。Vivi-18Sf/r 作为内参引物（表1）。
脱毒处理方法：（1）化学处理 将切取的茎尖移入病毒醚的终浓度分别为15 µg/mL和25 µg/mL的MS培养基中，每个处理设3次重复，然后在室温24 °C条件下进行培养，处理50d。（2）热处理 将切取的茎尖移入基本的MS培养基中，设3次重复，先在室温24 °C下放置10d，然后移入光照培养箱内，逐渐升温至37 °C，处理50d。（3）热处理结合化学处理 将切取的茎尖移入含病毒醚的终浓度分别为15 µg/mL和25 µg/mL的MS培养基中，每个处理设3次重复，先在室温24 °C下放置10d，然后移入光照培养箱内，逐渐升温至37 °C，处理50d。每5d记录一次处理过程中植株的生长状况，统计新生的侧枝（≥ 5 mm）数，并测量植株的株高。当处理到30d、40d、50d时分别切取1.0 mm茎尖（主芽和侧芽），移入新鲜的基本MS扩繁培养基中，记录再生植株的成活率，采用RT-PCR的方法对再生植株中的病毒进行检测，对检测无毒的样品采用荧光定量PCR技术进行进一步确认。
2 结果与分析
2.1 病毒醚和高温对葡萄试管苗株高和增殖的影响
处理20d时，含病毒醚（R15和R25）的处理未表现药害，处理植株与对照组（CK）几乎一样；处理30d时，R15和R25的植株叶片开始变黄变褐，且株高开始受到影响，明显比CK植株矮小（表2）。热处理（T）和热处理结合化学处理（R15+T和R25+T）的植株在处理过程中明显高于CK、R15和R25。此外，T、R15+T和R25+T植株从开始处理到结束均受到不同程度的热损伤，主要表现为褪绿、黄化、褐化、萎蔫或坏死。所有处理组植株的增殖均未表现明显差异。
2.2 病毒醚和高温对处理和再生葡萄试管苗成活率的影响
处理结束后，各处理组的植株均未出现死亡的现象。各处理组在不同的处理时期切取1.0mm的茎尖进行再生。当茎尖分化成植株并稳定生长后进行继代，继代5次后对成活率进行统计（表3）。所有处理的平均成活率大于68.0%。R15+T组处理30d再生植株的成活率最高为97.3%。病毒醚的浓度和处理时间与再生植株的成活率有明显联系（表3）。
2.3 两种病毒的脱除效果分析
茎尖成活后进行5次继代培养，然后采用RT-PCR和荧光定量PCR技术进行病毒检测。结果表明：R15和R25处理50d两种病毒的脱除率均较对应处理时间热处理结合化学处理的脱除率低。尤其是GRSPaV，单独R25的脱除率不足15%，而R25+T的脱除率高达100%。两种病毒的脱除率均呈现随着病毒醚的浓度和处理时间增加而增加的现象。此外，荧光定量PCR方法可有效提高病毒检测的灵敏性（表3）。
3 讨论
GRSPaV是侵染最为普遍的葡萄病毒，世界范围内栽植的葡萄品种和砧木中均有发生。研究发现，该病毒难以用热处理、茎尖培养等方法脱除。病毒醚为植物常用病毒抑制剂，在植物病毒的脱除研究中已被广泛应用，在本研究中单独病毒醚处理对植株中的GRSPaV未表现出良好的抑制作用，将其与热后处理相结合后，脱除效率显著升高。此外，两种方法的结合也有利于植株的生长。因此，该方法对葡萄病毒的脱除具有较好的应用前景。