种苗扩繁与生产技术岗位

裴旋旋 史宁 卢浩成 潘秋红 何非 王军

 

  摘  要：‘贝达（Beta）’是国内外广泛使用的葡萄砧木品种，也有地区将其果实用于鲜食或葡萄酒的酿造。本研究采用脱氧核糖核酸(DNA)指纹技术对采集的‘贝达’葡萄进行鉴定，测定葡萄果实的理化指标，并利用气相色谱-质谱(GC-MS)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对其挥发性香气成分和酚类物质进行分析。结果表明，研究所用砧木葡萄品种通过鉴定确认为‘贝达’，果实糖度为18.07ºBx，酸度为19.9 mg/g；分别共鉴定出游离态、结合态香气物质70种、44种，其中C6、C9化合物含量最高，占总香气物质90%以上；果实花色苷中甲基花翠素类花色苷含量最高(108.68 mg/kg)；黄酮醇中槲皮素类含量最高(47.48 mg/kg)；表儿茶素在果皮和种子中含量最高，分别为1,819.72 mg/kg和2,009.62 mg/kg。‘贝达’葡萄果实的品质分析可为其高效利用提供依据。

 

  关键词：‘贝达’葡萄；挥发性香气物质；酚类物质；品质；气相色谱-质谱；高效液相色谱-质谱

 

  ‘贝达（Beta）’葡萄原产于美国，是由河岸葡萄（Vitis riparia）和美洲葡萄（V. labrusca）杂交而成，早年引入我国。‘贝达’葡萄果实风味浓郁，是我国东北地区常见的庭院栽培鲜食葡萄，在一些地区还用其酿造迟采葡萄酒和冰葡萄酒。

 

  葡萄果实品质由基本理化指标、香气物质、酚类物质组成及含量等多个方面共同决定。香气是葡萄果实重要的感官属性，葡萄果实中的香气以游离态和糖苷结合态的形式存在，是葡萄酒品种香的来源，其种类、含量和香气阈值间的相互作用决定了其酿造的葡萄酒的品种典型性。酚类物质的含量和组成对葡萄果实品质及葡萄酒的外观、口感和稳定性有重要作用。目前，对于‘贝达’葡萄的研究多侧重于其作为砧木的特性，比如抗寒性、抗旱性、扦插生根能力和嫁接亲和力，但关于其果实的品质分析研究还未见报道。

 

  本研究采用脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)指纹鉴定技术对葡萄品种进行鉴定，测定果实的理化指标，利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）和液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）检测香气物质和酚类物质的组成和含量，以期为‘贝达’葡萄的高效利用提供依据。

 

  1 材料与方法

 

  1.1 材料与试剂

 

  1.1.1 实验材料

 

  ‘贝达’葡萄果实于2020年9月16日采于吉林省吉林市左家镇中国农科院特产研究所国家山葡萄种植资源圃（125º25′E，43º46′N），土壤为沙壤土。采集的样品装入冰盒中运送，并用液氮速冻后保存于-40℃的冰箱中贮存，备用。

 

  1.1.2 实验试剂

 

  糖苷酶AR2000（250 U/g）：荷兰DSM Food Specialties公司；乙酸钠、甲醇、二氯甲烷、氢氧化钠（均为分析纯）：北京化工厂；β-D-葡萄糖酸内酯（分析纯）：生工生物工程上海（股份）有限公司；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）：上海麦克林生化试剂有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒DP3091：北京百泰克生物技术公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVPP），儿茶素[(+)-Catechin, C]、表儿茶素[(-)-Epicatechin, EC]、表棓儿茶素[(-)-Epigallocatechin, EGC]、表儿茶素没食子酸酯[(-)-Epicatechin-3-O-gallate, ECG]、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品(纯度＞98%)：美国Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯）：德国Fisher公司；Cleanert PEP固相萃取柱（150 mg/6 mL）：天津博纳艾杰尔科技公司。

 

  1.2 仪器与设备

 

  NanoDrop紫外-可见分光光度计、Micro 17R离心机：赛默飞世尔科技公司；T100聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)基因扩增仪：美国Bio-Rad公司；EC300凝胶成像系统：美国UVP公司；FD-1C-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪：睿科集团股份有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；Agilent 6890气相色谱仪、Agilent 5975质谱联用(GC-MS)仪、Agilent 1200系列高效液相色谱-三重四级杆(triple quadrupole, QqQ)质谱联用仪、Agilent 1200系列高效液相色谱串联Bruker系列离子阱质谱联用仪：美国Agilent公司。

 

  1.3 实验方法

 

  1.3.1 品种DNA指纹鉴定

 

  DNA提取：利用植物基因组DNA提取试剂盒提取葡萄基因组DNA，提取后用NanoDrop紫外-可见光分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。

 

  简单重复序列-聚合酶链式反应(simple sequence repeat-polymerase chain reaction, SSR-PCR)扩增：SSR引物信息见表1。质量合格的DNA用于SSR-PCR扩增，PCR反应体系：2.5 μL DNA模板，正向引物和反向引物各0.75 μL，2Taq PCR mix 12.5 μL，ddH2O 12.5 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃末延伸5 min。扩增结束后，取3 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

 

  产物检测及分析：将电泳检测条带清晰，带型稳定的PCR扩增产物20 μL送至金唯智生物科技有限公司进行短串联重复序列（short tandem repeat, STR）检测，并用Genemapper V3.2软件进行条带分析，确定每个等位基因片段大小。

 

 

  1.3.2 果实理化指标检测

 

  可溶性固形物的测定：采用手持糖度仪；pH值的测定：采用pH计；可滴定酸的测定：参考WEN Y Q等方法。

 

  1.3.3 果实香气物质的提取和检测

 

  游离态香气物质的提取：参考WEN Y Q等的方法。

 

  结合态香气物质的提取：参考WEN Y Q等的方法。

 

  香气物质的检测：采用本实验室已经优化的顶空固相微萃取-气相色谱质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometer, HS-SPME-GC/MS）联用方法进行测定。检测方法参考胡丽等的方法。GC条件：参考WU Y W等的条件。

 

  定性与定量分析：挥发性香气物质的定性：根据美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology, NIST）14标准谱库中的保留指数（retention index, RI）和质谱信息进行定性分析。挥发性香气物质的定量：参考ZHANG M X等的方法，对于有标准品的香气物质直接用相应标准品的标准曲线定量，没有标准品的香气物质用具有相似化学结构或相近碳原子数的标准品进行半定量，香气物质含量以果实鲜质量计。

 

  1.3.4 果皮花色苷和黄酮醇的提取和检测

 

  葡萄果皮花色苷和黄酮醇的提取：参考DOWNEY M O等的方法。

 

  花色苷的测定：使用Agilent 1200系列高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（high performance liquid chromatography coupled with triple quadruple mass spectrometry, HPLC-QqQ-MS）进行测定，HPLC条件：参考胡丽等的条件。

 

  定性定量方法：根据花色苷高效液相色谱-紫外-质谱（high performance liquid chromatography ultraviolet mass spectrometry, HPLC-UV-MS）指纹谱库对花色苷进行定性，以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物对花色苷物质进行定量。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的标准曲线回归方程为Y=10-12X2+10-5X+2.0855，相关系数R²=0.9995。果皮中的花色苷含量均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计，并以mg/kg果实鲜质量表示。

 

  黄酮醇的测定：使用Agilent 1200系列高效液相色谱串联Bruker系列的离子阱质谱联用仪。HPLC条件：参考胡丽等的条件。

 

  定性与定量分析：参考朱燕溶等对黄酮醇物质进行定性，以槲皮素-3-O-葡萄糖苷为外标物对黄酮醇物质进行定量，槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准曲线回归方程为Y=113.45X+567.7700，相关系数R²=0.9985。果皮中的黄烷醇含量均以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量计，并以mg/kg果实鲜质量表示。

 

  1.3.5 果皮和种子黄烷醇的提取和检测

 

  游离黄烷醇的提取：参考LIANG N N等的方法。

 

  裂解黄烷醇的提取：参考LIANG N N等的方法。

 

  黄烷醇的测定：使用Agilent 1200系列高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（HPLC-QqQ-MS/MS）。HPLC条件：参考胡丽等的条件。

 

  定性与定量分析：根据黄烷醇HPLC-UV-MS指纹谱库对黄烷醇进行定性，以C、EC、EGC、ECG四种黄烷醇单体为外标物进行定量。儿茶素(C)的标准曲线回归方程：Y=10-10X2+9×10-5X+1.6414，相关系数R²=0.9998；表儿茶素（EC）的标准曲线回归方程：Y=10-10X2+10-4X-0.2715，相关系数R²=0.9999；表棓儿茶素（EGC）的标准曲线回归方程：Y=3×10-11X2+4×10-5X+3.2201，相关系数R²=0.9996；表儿茶素没食子酸酯（ECG）的标准曲线回归方程：Y=10-10X2+3×10-5X+4.7677，相关系数R²=0.9963。初始单元和延伸单元的总摩尔数与初始单元的摩尔数的比值得到平均聚合度（mean degree of polymerization, mDP）。果皮和种子中的黄烷醇含量均以mg/kg果实鲜质量表示。

 

  1.3.6 数据处理

 

  用Microsoft Excel 2016进行平均值和标准差的计算、标准曲线绘制。

 

  2 结果与分析

 

  2.1 品种真实性鉴定

 

  SSR指纹是葡萄品种鉴定常用的分子标记，本实验采用VVS2、VVMD5、VVMD7、VVMD25、VVMD27、VVMD28、VVMD32、VRZag62、VRZag79等九对引物对‘贝达’葡萄基因组DNA进行PCR扩增，并将扩增结果与国际葡萄品种目录（Vitis international variety catalogue, VIVC）标准数据库（http://www.vivc.de/）进行比对，以确定‘贝达’葡萄品种的真实性，比对结果见表2。由表2可知，‘贝达’葡萄基因组DNA扩增到的等位基因大小与VIVC标准数据库收录数据并不完全一致，但差异小于3 bp，可以证实葡萄品种为‘贝达’。

 

 

  2.2 葡萄果实的理化指标

 

  理化指标反映葡萄果实的基本品质。经过测定，‘贝达’葡萄果实的百粒质量为104.48 g，可溶性固形物含量为18.07ºBx，pH为3.01，可滴定酸含量为19.9 mg/g，呈现明显的低糖高酸特征，因此在酿造葡萄酒时需要进行工艺降酸。

 

  2.3 果实香气物质分析

 

  利用GC-MS对‘贝达’葡萄果实的游离态和结合态香气进行测定，结果见表3。

 

 

  由表3可知，共检测到70种游离态香气物质，其中C6、C9化合物16种，萜烯类11种，降异戊二烯类8种，高级醇类7种，酯类11种，苯类6种，挥发性酚类2种，其他类9种；共检测到44种结合态香气物质，其中C6、C9化合物10种，萜烯类6种，降异戊二烯类2种，高级醇类6种，酯类6种，苯类6种，挥发性酚类2种，其他类6种。游离态和结合态香气物质中，C6、C9化合物含量最高，占总香气物质的90%以上，其次为酯类物质，而萜烯、降异戊二烯、高级醇、苯类以及挥发性酚类香气物质的含量相对较低。

 

  游离态香气物质1-己醇、(E)-2-己烯醛、己醛以及结合态香气物质1-己醇、己醛是‘贝达’葡萄果实中含量较高的C6、C9化合物，对葡萄果实中‘生青味’、‘植物味’具有重要贡献。萜烯类物质是葡萄果实中花香和果香的重要来源，可用于分析品种特性，且在葡萄酒酿造的过程中能够稳定存在，对葡萄酒香气有重要贡献。‘贝达’葡萄果实中游离态的香叶醇、γ-萜品烯、萜品油烯以及结合态萜品油烯等萜烯类物质含量相对较高。高级醇中，游离态1-丁醇的含量相对较高，提供‘药材味’。酯类物质在‘贝达’葡萄果实中主要以游离态形式存在，是成熟果香味的重要来源，在‘贝达’葡萄果实中游离态丁酸乙酯的相对含量较高，赋予其浓郁的‘菠萝’、‘香蕉’、‘草莓’等水果香气。苯类物质中，结合态β-苯乙醇的含量相对较高，提供‘玫瑰’、‘蜂蜜’等令人愉悦的气味。在‘贝达’葡萄果实中只检测到苯酚和丁子香酚两种挥发性酚类物质，其中结合态丁子香酚含量较高，具有‘肉桂’等香料味。

 

  虽然一些香气物质含量较高，但其感官阈值也较高，从而不易被人们所感知。香气活度值（OAV）是评价某种挥发性化合物对其体系香气贡献大小的指标，一般认为OAV＞1的香气物质能够被感知且对葡萄果实特征香气具有重要贡献[29-30]。游离态香气物质与葡萄果实的感官特性直接相关，由表3可知，虽然游离态的β-大马士酮、己酸乙酯含量较低，但其感官阈值也较低，因而具有较高的香气活度值（OAV＞50），赋予‘贝达’葡萄果实‘甜味’、‘香蕉’、‘青苹果’等香气；另外游离态的1-己醇、己醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-壬烯醛、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、氧化玫瑰、丁酸乙酯的香气活度值（OAV＞1）也相对较高，赋予‘贝达’葡萄果实‘植物味’、‘玫瑰’、‘紫罗兰’等花香，以及‘荔枝’、‘香蕉’、‘菠萝’、‘草莓’等水果香气[23-27]。结合态香气物质可作为储备香气，在葡萄酒发酵和陈酿过程中水解成游离态的挥发性香气物质，因此可用来评估葡萄香气潜力。结合态的1-己醇、丁子香酚、1-辛烯-3-酮的OAV均大于1，提供葡萄果实‘植物味’、‘香料味’、‘蘑菇味’等香气。

 

  2.4 果实类黄酮物质

 

  2.4.1 果皮花色苷组成

 

 

 

  由表4可知，在‘贝达’葡萄果实中共检测到30种花色苷，包括15种花色素单糖苷和15种花色素双糖苷。‘贝达’葡萄果实中甲基花翠素类花色苷含量最高，为108.68 mg/kg，其次为花翠素类花色苷，含量为76.88 mg/kg，甲基花青素类花色苷稳定性强，但其含量要显著低于其他种类花色苷。一般来说，花色素双糖苷稳定性高于花色素单糖苷，但是‘贝达’中花色素单糖苷含量度显著高于花色素双糖苷。含量较高的有甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（55.40 mg/kg）、花翠素-3-O-香豆酰葡萄糖苷（47.74 mg/kg）、花青素-3-O-葡萄糖苷（38.05 mg/kg）、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（32.61 mg/kg），这几种花色苷占花色苷总含量的51.92%。花色苷的葡萄糖基可以与乙酸、对香豆酸、咖啡酸发生酯化反应分别生成乙酰化、香豆酰化、咖啡酰化的花色苷，从而增强花色苷的稳定性。‘贝达’葡萄果皮中未检测到咖啡酰化的花色苷，含量最高的是未酰化花色苷（151.45 mg/kg，45.25%），其次为香豆酰化花色苷（115.88 mg/kg，34.63%），乙酰化花色苷含量最低（67.35 mg/kg，20.12%）。

 

  2.4.2 果皮黄酮醇组成

 

  根据黄酮醇分子C环上羟基取代基的不同，形成不同的黄酮醇糖苷化合物，这些取代基主要有葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸[38]。‘贝达’葡萄果实黄酮醇检测结果见表5。

 

 

  葡萄果实中的黄酮醇多以糖苷形式存在，在‘贝达’葡萄果实中检测到6种常见的黄酮醇糖苷配基，分别为槲皮素、杨梅酮、山奈酚、西伯利亚落叶松黄酮、丁香亭和异鼠李素。由表5可知，‘贝达’葡萄果实中槲皮素类黄酮醇含量最高，为47.48 mg/kg，其次为杨梅酮类，而丁香亭类和西伯利亚落叶松黄酮类含量极低。不同种类黄酮醇在葡萄果实中的合成途径不同：F3’5’H途径合成的是杨梅酮类、西伯利亚落叶松黄酮类和丁香亭类黄酮醇；F3’H途径合成的是槲皮素类和异鼠李素类黄酮醇；F3H途径合成的是山奈酚类黄酮醇。‘贝达’葡萄果实中F3’H途径合成的黄酮醇最多，而F3H途径合成黄酮醇最少。

 

  ‘贝达’葡萄果实中共检测到10种黄酮醇类物质，总含量为91.17 mg/kg，其中含量最高的是槲皮素-3-O-葡萄醛酸苷，为32.16 mg/kg，其次为杨梅酮-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷，含量分别为16.29 mg/kg和15.32 mg/kg，这3种黄酮醇占黄酮醇总含量的69.94%。

 

  2.4.3 果实黄烷醇组成

 

  葡萄果实中的黄烷醇主要存在于种子和果皮当中，少量存在于果肉中。黄烷醇基本单元既能以儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表棓儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等单体形式存在，也可以聚合体缩合单宁的形式存在。‘贝达’葡萄果实黄烷醇检测结果见表6。

 

 

  由表6可知，‘贝达’葡萄种子中黄烷醇总含量（2,252.10 mg/kg）高于果皮黄烷醇总含量（1,897.11 mg/kg），果皮和种子的黄烷醇中均为延伸单元所占的比例最高，分别占果皮和种子黄烷醇总含量的99.74%和92.20%，而游离单元所占比例最少，种子中游离单元总含量为175.72 mg/kg，而果皮游离单元总含量为5.00 mg/kg。表儿茶素延伸单元在果皮和种子中含量最高，分别为1,819.72 mg/kg和2,009.62 mg/kg，其次为儿茶素末端单元。种子中未检测到表棓儿茶素游离单元和儿茶素延伸单元，‘贝达’葡萄果皮黄烷醇的平均聚合度（mDP）要高于种子的平均聚合度（37.66 vs. 17.32）。

 

  3. 讨论

 

  ‘贝达’葡萄果实游离态和结合态香气物质中均是C6、C9化合物含量最高，特别是游离态的1-己醇、(E)-2-己烯醛、己醛和结合态1-己醇，这与常见的一些酿酒葡萄品种的果实香气具有相似性，如‘赤霞珠’葡萄果实中(E)-2-己烯醛、己醛的含量最高，‘蛇龙珠’和‘美乐’中2-己烯醛的含量最高。不同的是，‘贝达’葡萄果实中酯类物质含量也相对较高，这与‘康可’、‘康拜尔’、‘黄金玫瑰’等品种相似。观察香气活度值（OAV），‘贝达’葡萄果实的特征香气物质主要是酯类、萜烯类和C6、C9化合物，相较于刘政海等研究的‘赤霞珠’、‘品丽珠’、‘马瑟兰’、‘美乐’、‘西拉’五个酿酒葡萄品种，‘贝达’葡萄果实呈现出更为浓郁的果香。

 

  花色苷种间和品种间差异较大，其含量和组成受严格的基因控制。有研究表明，欧亚种酿酒葡萄果实中花色苷几乎为花色素单糖苷，而花色素双糖苷一般存在于山葡萄、刺葡萄、毛葡萄以及杂种葡萄果实中。‘贝达’葡萄果实中以花色素单糖苷为主，含有少量双糖苷。值得注意的是，‘贝达’葡萄果实中甲基花翠素类花色苷含量最高，而在大部分的欧亚种葡萄、山葡萄、山欧杂种葡萄，以及某些鲜食葡萄（如‘巨峰’）果实中，二甲花翠素类花色苷的含量均最高。HILBERT G等研究表明，在欧亚种中含量最高的是槲皮素类黄酮醇，野生种葡萄果实中含量最高的是杨梅酮类黄酮醇。而在本研究中‘贝达’葡萄果实槲皮素类黄酮醇含量最高，其次为杨梅酮类，其黄酮醇含量和组成与欧亚种葡萄和野生种葡萄有明显差异。与‘赤霞珠’等红色酿酒葡萄类似，‘贝达’葡萄种子中黄烷醇含量要高于果皮，且果皮和种子的黄烷醇延伸单元含量高达90%以上。

 

  4 结论

 

  葡萄果实被鉴定为‘贝达’品种，果实的糖度为18.07ºBx，酸度为19.9 mg/g；游离态、结合态香气物质分别为70种、44种，其中游离态、结合态的C6、C9化合物分别为16种、10种，含量最高，占总香气物质的90%以上；甲基花翠素类花色苷含量最高（108.68 mg/kg）；槲皮素类黄酮醇含量最高（47.48 mg/kg）；表儿茶素在果皮和种子中含量最高，分别为1,819.72（mg/kg）和2,009.62（mg/kg）。综上所述，本研究结果可为‘贝达’葡萄的高效利用提供依据。