种苗扩繁与生产技术岗位

卢浩成 何非 王军

 

  摘要：葡萄树叶幕遮光是应对全球气候变暖的一项广泛应用的措施。在本研究利用遮阳网对葡萄下半部叶幕进行了遮光处理，处理时期为绿果期到采收期。与对照（不进行遮光处理）相比，叶幕遮光处理减少了果际区域74.6%的入射光总辐射，并且显著降低了果际区域的温度。遮光部分叶片的净光合速率降低，葡萄果实成熟延缓，并且可滴定酸含量比对照更高。此外，叶幕遮光处理显著提高了葡萄果实和其酿造葡萄酒中花色苷的浓度，但显著降低了二者黄酮醇的浓度。遮光处理所酿葡萄酒中酯类物质和β-大马士酮要显著高于对照处理葡萄酒，从而使遮光处理葡萄酒花香果香更加浓郁。本研究结果说明叶幕遮光对葡萄中的代谢产物和葡萄酒的风味轮廓有显著影响。

 

  关键词：葡萄，葡萄酒，叶片气体交换，风味轮廓

 

  1.引言

 

  伴随着全球变暖，近些年来越来越多的国家出现了酿酒葡萄成熟过快的问题，物候期的缩短成为了成熟过快的直接证据（Lobell et al., 2008）。成熟过快导致采收时葡萄果实的可溶性固形物含量过高，酒的酒精度过高（(Parra et al., 2010; Sadras and Petrie, 2012）。伴随此问题而来的还有采收时酸度过低、pH过高以及典型风味的缺失（Jiang et al., 2017）。现在的消费者对于健康饮酒的观念越来越重视，更加喜欢酒精度适中的葡萄酒（Palliotti et al., 2014）。酒精度过高不仅会失去一部分市场竞争力，而且还会影响发酵过程中菌株的耐受性。为了降低葡萄酒的酒精度，世界各地的葡萄酒酿造企业采取了一系列措施。例如在发酵过程中利用膜技术、超临界萃取和真空蒸馏，但是这些技术需要花费很高的成本（Palliotti et al., 2014）。而利用栽培技术延缓葡萄成熟，改善葡萄酒的风味，就显得尤为必要。

 

  为了避免高温对葡萄的不利影响，遮光处理已经被越来越多的人研究并应用。目前广泛应用的遮光方式主要有三种：1）顶部遮光：叶幕上方放置T形架来支撑遮光网，从而将葡萄树的全部叶幕遮住（Caravia et al., 2016）。2）叶幕遮光：利用遮光网将葡萄叶幕两侧部分或全部遮住（Caravia et al., 2016; Martínez-Lüscher et al., 2016）。3）果穗遮光：利用果袋或纸盒将果穗全部覆盖（Downey et al., 2008; Ristic et al., 2007）。一些品种例如桑娇维赛和赛美蓉，叶幕的部分遮光和全部遮光都已经用来研究其对果实品质的影响（Greer et al., 2011）。结果表明，在葡萄的整个生长期内，遮光处理对其叶幕和浆果的质量都有持续的影响，浆果重量、酚类物质的积累都有显著的降低，总酸明显增加，叶片的光合作用也受到显著影响。Rojas-Lara等（1989）则研究了在开花后两周叶幕遮光对赤霞珠的影响。结果表明，果实的重量，糖分以及花色苷的含量都显著下降；而且遮光处理的叶幕温度要比对照组高，果实温度没有显著差异。

 

  在新疆玛纳斯产区，气候干旱少雨，赤霞珠葡萄成熟速度较快。为了延缓赤霞珠葡萄的成熟，设置了部分叶幕遮光处理。本研究通过对树体生理指标的测定，浆果和葡萄酒品质的测定来评估叶幕遮光的适用性。

 

  2.材料和方法

 

  2.1 试验地选择，气象数据的获取和遮光处理

 

  试验材料为‘赤霞珠’葡萄。试验地位于新疆维吾尔自治区玛纳斯县中信国安葡萄酒业有限公司自建基地（44°14′N，86°15′E），土壤类型为砂质壤土，半干旱气候。该试验田所选‘赤霞珠169’为2011年种植的自根苗，叶幕形为改良后的VSP（Cheng et al., 2014），栽培行株距为2.8 m×1 m，行向为北偏东52°，结果带位于地面上60 cm。短枝修剪，留梢量12～15支/株，留果量1～2穗/新梢。每个生长季共灌溉五次：萌芽、开花、座果、转色期和采收前。每次灌溉量为150 m3·ha−1。病虫害处理及施肥量由当地标准而定，其他处理采用常规田间管理。试验地近十年的气象数据由中国气象网获取（http://cdc.cma.gov.cn/），关注的指标有温度和日照时数。

 

  遮阳网由聚乙烯制成，0.1 mm厚，1.2 m宽，透光率为25%。遮光处理（ST）的位置为叶幕上方1.3 m到第二个架面以下，约占总叶幕的50%总面积。对照（UC）为不遮光处理。采用随机区组设计，分布于相邻的三行葡萄树。每个重复包括30棵长势相似的葡萄树。遮光时间为2018年绿果期（花后四周）到采收期。

 

  2.2 果际微气候和浆果采集

 

  果际微气候由微型气象站（Hobo® micro station, Onset corporation, USA）测定。记录的数据包括温度，湿度和总辐射，每五分钟记录一次。测量时间从处理后一直持续到采收前。

 

  葡萄果实的采集为随机采样，遮光处理前采第一次样，之后在重要的物候期进行采样：转色开始，转色完成，采收前，采收。当各处理果实的可溶性固形物含量到23°Brix左右时分别进行采收。共3个重复，每个重复选取长势一致的30株葡萄树，每次每个果穗采集5粒果实，果穗曝光面上部、中部、下部各采1粒，果穗背光面中部采集2粒，采收期前每次重复约采集100粒浆果，用于基本理化的检测。采收期采集500粒浆果，其中100粒用于基本理化的测定，剩余400粒在液氮中冷冻后放入-80℃冰箱以供后期酚类物质和香气物质的检测。

 

  2.3 叶片气体交换指标的测定

 

  利用LI-6400便携式光合测定系统（LI-6400, Li-Cor Inc., Lincoln NE, USA）进行光合速率的测定。测定的位置为从基部起第6~8节叶片（遮光处理为叶幕内部），测定的时间为处理后到采收前。每次均测定同样的叶子以保证不同时期测定的一致性。每次测定的时间保持在11:00~13:00之间，不同处理的不同重复采取随机测定的方式，以消除测量时间的误差。测定指标包括净光合速率（AN），蒸腾速率（E），气孔导度（gs），胞间CO2浓度。

 

  2.4 小规模发酵

 

  在处理和对照果实的可溶性固形物含量分别到达23°Brix左右时，进行小罐发酵试验，每个处理采收60 kg果穗（共3个生物学重复，每个生物学重复20 kg）。人工破碎除梗后入罐，入罐同时加入20 mL 4% H2SO3和0.4 g果胶酶（Optivin, Australia）。入罐24 h后添加4 g活化好的Lalvin D254酵母。干净纱布盖住发酵罐口，每天早晚压帽两次，控制酒精发酵温度在22°C左右，并测定其比重和温度。酒精发酵结束后（比重降至0.998以下且维持两天不再变化）进行皮渣分离，自流汁及压榨汁移至10 L密闭玻璃容器，添加乳酸菌进行苹-乳发酵，水封隔绝氧气，控制发酵温度为20°C左右。苹-乳发酵结束后加入12 mL 6%H2SO3并装瓶，置于酒厂酒窖待测。

 

  2.5 葡萄和葡萄酒理化指标的测定

 

  100粒浆果用分析天平称量，计算浆果百粒重和平均单粒质量。随机选取100粒浆果挤出果汁，用手持折光仪（PAL-1, Atago, Japan）测定可溶性固形物含量，用pH计测定pH值；可滴定酸使用NaOH滴定。

 

  酒样常规指标酒精度、残糖、总酸、挥发酸、SO2、pH值等测定方法参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

 

  酒样的色度色调（CIELab）用紫外分光光度计进行测定，以蒸馏水为对照，在440 nm、530 nm、600 nm 三个波长下检测吸光度值。计算参数L值（亮度）、c值（饱和度）、a值（a>0，红色色调；a<0，绿色色调）和b值（b>0，黄色色调；b<0，蓝色色调）（Ayala et al., 1997）。

 

  2.6 葡萄中酚类物质的提取

 

  果皮中花色苷和黄酮醇提取方法如下（Downey et al., 2007）：准确称取0.1000 ± 0.0002 g葡萄果皮（肉）冻干粉于2.5 mL离心管中，加入1 mL 50%甲醇水溶液，20°C下避光超声萃取20 min后，于4°C、8000 rpm离心10 min，随后转移上清液于新的2.5 mL离心管中，残渣再按照上述步骤重复提取一次，合并两次提取的上清液，充分混合均匀，于-80°C冰箱保存待测。

葡萄果皮和种子中黄烷醇的提取方法参考Liang等（2012），并进行优化：

 

  游离黄烷醇的提取。准确称取0.1000 ± 0.0002 g葡萄果皮冻干粉于5 mL的离心管中，加入1 mL 70%的丙酮水溶液（含0.5%的抗坏血酸）。充分震荡后在10000 rpm，4°C条件下离心15 min，取上清液于新的5 mL离心管中，残渣重复提取三次，将多次提取所得的上清液合并。取400 μL提取液于1.5 mL离心管中，在常温下进行氮吹，用200 μL含1% HCL的甲醇溶液溶解，再加入200 μL的乙酸钠水溶液（200 mM）中和，于-80°C冰箱保存待测。

 

  聚合黄烷醇的裂解和提取。准确称取0.1000 ± 0.0002 g葡萄果皮冻干粉于10 mL的离心管中，加入1 mL的间苯三酚缓冲液（含0.3 M HCL、50 g/L间苯三酚和0.5%抗坏血酸的甲醇溶液），50°C水浴20 min后，加入1 mL乙酸钠（200 mM）终止反应，于4°C、8,000 rpm离心15 min后，取出上清液置于新的10 mL离心管中，重复操作提取三次，将上清液合并，于-80°C冰箱保存待测。

 

  2.7 葡萄和葡萄酒中酚类物质的检测

 

  葡萄果实和葡萄酒花色苷检测采用美国Agilent 1200系列高效液相色谱仪，配备6410三重串联四级杆质谱仪（QqQ）。所用色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（150 × 3.0 mm, 2.7 μm）。果实提取液/酒液测定前经0.22 μm有机相滤膜过滤，进样量5 μL。洗脱采用的流动相为：0.1%的甲酸水溶液为A相，含0.1%甲酸的50/50的甲醇乙腈溶液为B相。洗脱程序为10%到100%的B相（90%到0%的A相）持续15 min，后运行程序5 min。流动相流速为0.4 mL/min。柱温箱温度控制在55°C。质谱采用AJESI离子源，正离子模式，喷雾电压为4 kV，离子源温度为150°C，干燥气温度为350°C，流量为12 L/h，雾化器压力为35 psi。检测器为多反应监测模式（MRM）。

 

  葡萄果实和葡萄酒非花色苷酚检测所用仪器、色谱柱、流动相、过滤方法同上，梯度洗脱程序为：0～28 min，10%～46% B；28～29 min，46%～10% B。洗脱结束后，维持10% B相冲洗5 min，平衡色谱柱。流速0.4 mL/min；进样量5 µL。质谱采用AJESI离子源，负离子模式，其余参数同上。

 

  酚类物质的定性和定量采用外标法，花色苷及其衍生物含量以含有相同花色素基元的-3-O-葡萄糖苷单体含量计算，表示为mg/kg FW（果实鲜重）或mg/L（葡萄酒）。黄酮醇以槲皮素为外标物，黄烷醇以儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素和表儿茶素没食子酸酯为外标物，单位表示为mg/kg FW（果实鲜重）或mg/L（葡萄酒）。

 

  2.8 葡萄酒中香气物质的检测

 

  利用顶空固相微萃取方法对葡萄酒香气物质进行萃取，并利用气质联用的方法分析样品中的香气物质（Wen et al., 2014）。载气为高纯氦气，流速为1 mL/min。升温程序如下：50°C保持1 min，然后以3°C/min 升温至220°C，最后保持5 min。其余条件如下：进样口温度为250°C，酒的检测采取5:1分流模式，葡萄汁的检测采取不分流模式，电离方式为电子电离 (electron ionization, EI) 源，电离能为70 ev，离子源温度为230°C，质谱接口温度为280°C，质量扫描范围为30~350 u。

 

  挥发性香气物质的定性根据NIST标准谱库中的保留指数和质谱信息进行分析。香气物质的定量根据对应的标准曲线来分析。

 

  2.9 数据分析

 

  采用SPSS 22.0进行统计分析，采用Origin 8.0、GraphPad Prism 8.0.2和R语言进行绘图，热图采用R语言中的‘complexheatmap’包进行绘制。

 

  3.结果

 

  3.1 气象数据和果际微气候

 

  经过比较十一年的气象数据（图1），进行试验的2018年生长季内的月均温度和日照时数与十一年来的均值很接近。2018年生长季内有20天均为高温天气（日最高温大于35°C），但是2018年葡萄生长季内的降水只有38.7，属于典型的半干旱气候。

 

 

图1 2018年葡萄生长季内的气象（a），2009~2019日照时数（b）和温度（c）的变化

 

  对葡萄叶幕进行遮光以后，果际周围的温度降低了（图2）。在气象站记录数据的83天中，遮光处理和对照的活动积温相差可达80°C左右（基于10°C），这说明日均温可降低1°C左右。总辐射方面，遮光处理后的日均总辐射可降低74.6%左右。在一天的变化中，遮光处理后最高温的降低幅度可达6°C；当对照的总辐射达到一天中的最大值375 W/m2时，遮光处理为100 W/m2。

 

 

  3.2 遮光处理对葡萄叶片气体交换的影响

 

  遮光处理显著降低了位于遮光网内叶片的净同化速率，如图3所示。在上午，降低的幅度可达9 μmol/m2/s。同样的结果也出现在整个生长季的五次测定中，位于遮光网内的叶片净光合速率均低于对照。但是叶幕上部位于遮光网外的叶片并没有表现出明显的补偿作用。对于蒸腾速率和气孔导度来说，遮光处理对二者的影响很小。但遮光处理显著升高了位于遮光网内叶片的胞间CO2浓度。

 

 

  3.3 遮光处理对葡萄果实理化指标的影响

 

  遮光处理对葡萄果实中可溶性固形物含量，可滴定酸，pH和果粒重量的影响如图4所示。从第二次采样开始，遮光处理显著降低了葡萄中的可溶性固形物含量，降低的幅度最大可达3°Brix。此时对照葡萄为转色接近100%的状态，而遮光处理的转色程度为50%左右。当对照采收时，可溶性固形物含量为23.5°Brix，而遮光处理仅为21°Brix，未达到成熟的标准。当遮光处理15天后达到23.6°Brix左右时，对照的可溶性固形物含量已经达到25.5°Brix。遮光处理显著增加了果实中的可滴定酸的含量，降低了pH，但可滴定酸的差距随着成熟期的延后而缩减。此外，遮光处理还显著降低了葡萄果粒的重量，虽然在采收时并未达到显著水平。

 

 

  3.4 遮光处理对葡萄果实中类黄酮物质的影响

 

  遮光处理对葡萄中花色苷和黄酮醇类物质的影响较大，但对黄烷醇类物质影响较小（表1）。遮光处理提高了葡萄中的总花色苷浓度和大部分类花色苷的浓度。仅有二甲花翠素类花色苷的浓度并未受到摘叶处理的影响。但从每粒浆果中花色苷的含量来看，遮光处理仅提高了花青素类和花翠素类花色苷的含量，而并未对总花色苷的含量造成影响。这说明遮光处理花色苷浓度的提高是通过果粒变小而浓缩的。遮光处理显著降低了果实中的黄酮醇类物质的浓度或含量，可达50%左右。黄烷醇方面，仅有末端单元受到摘叶处理的影响。

 

 

  3.5 遮光处理对葡萄醪/酒基本理化指标和酚类物质的影响

 

  遮光处理对葡萄醪/酒基本理化指标和酚类物质的影响如表2所示。由于遮光处理和对照控制在同一成熟度进行采收，二者的可溶性固形物含量并未显著差异，但在发酵完成后的酒中，遮光处理的酒精度要显著低于对照。虽然在入罐时，对照和处理葡萄醪中可滴定酸和pH无显著差异。但发酵完成后遮光处理的总酸要显著低于对照，pH要显著高于对照。

 

  葡萄酒中的酚类物质方面，与果实结果一致的是，遮光处理显著提高了葡萄酒中花色苷类物质的浓度，但显著降低了黄酮醇类物质的浓度。此外，遮光处理还显著降低了葡萄酒中黄烷醇类物质的浓度，但对酚酸类物质的浓度没有显著影响。通过对葡萄酒颜色的测定，遮光处理显著提高了葡萄酒的亮度，降低了红色色调。

 

 

 

  3.6 遮光处理对葡萄酒中香气物质的影响

 

  在两个处理葡萄酒中共检测到了54种香气物质，按照结构分成了9大类，如图5所示。和对照相比，遮光处理显著提高了葡萄酒中降异戊二烯，酯类物质和脂肪酸类物质的浓度，但显著降低了苯类物质，高级醇类物质的浓度。经过计算不同香气物质的香气值，遮光处理显著增加了花香、果香、焦糖香和烘烤香的香气值，但同时也提高了葡萄酒中的脂肪味和化学味。

 

  不同处理葡萄酒中主要的香气物质如图6所示。利用聚类分析将酯类物质、高级醇类物质、降异戊二烯类物质、C6醇类物质、脂肪酸类物质和苯类物质分别进行分析。结果表明，除琥珀酸乙酯、乙酸苯乙酯和3-甲基丁酸乙酯在遮光处理的葡萄酒中显著降低外，高香气值的酯类物质例如3-甲基-1-丁基乙酸酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸乙酯均在遮光处理的葡萄酒中显著提高了。高级醇类物质中，遮光处理显著减少了3-甲基-1-丁醇的浓度，此物质具有较高的香气值且具有化学味和脂肪味。遮光处理显著提高了葡萄酒中的β-damascenone的浓度，这对提高葡萄酒的花香果香有重要作用。

 

 

  4.讨论

 

  优质和完全成熟的葡萄是酿造优质葡萄酒的前提，如果葡萄成熟过早，糖含量过高而酸度过低，将会导致葡萄酒酒精感过强，缺乏新鲜度；成熟过晚会导致采收时葡萄成熟不完全和酿成葡萄酒的生青味（Parker et al., 2020）。本研究没有在同一天进行采收，因为两个处理葡萄的成熟进程显著不同：当遮光组葡萄即将成熟，对照组葡萄还未成熟。因此，遮光和对照组葡萄在成熟度接近一致时才进行采收并酿酒，而不是在同一天进行采收。之前的一项研究中显示，欧洲12个地区中有11个地区的收获日期平均比50年前早17天（Jones et al, 2005）。此外，1997年波尔多葡萄的收获日期在比1952年提前了13天（Jones and Davis, 2000）。本研究中，对照组比遮光组葡萄晚成熟15天，因此，这种处理在将来可以应对物候期提前的问题。与之前大多数研究中温和的处理不同，本研究分别减弱了果穗区75%和叶幕区50%的太阳辐射，使得遮光组和对照组的微气候差异巨大，这在葡萄长势、气体交换、葡萄及葡萄酒的代谢物上有显著的影响：遮光组的日平均温度下降1℃，正午温度下降6℃，这与之前叶幕区遮阴导致正午温度下降的研究结果一致（Rana et al., 2004）。与对照组相比，叶幕遮阴也降低了高温天数，这对于保护葡萄免受高温胁迫有显著作用。

 

  在本研究中，遮光处理中有一半的叶幕叶片的净同化速率要低于对照处理，更低的同化速率减少了其生物量的产生和积累，这与之前的研究一致（Greer et al., 2011）。遮光处理显著地增加了叶片的胞间CO2浓度，已有研究发现胞间CO2浓度与光合作用呈负相关（Greer, 2012）。在未遮光的上层叶幕叶片中没有发生补偿作用，因此净同化速率没有明显降低。当叶片的光合有效辐射降低时，叶绿素b含量增加，叶绿素a/b比值降低。弱光下叶绿素b含量的增加是由于叶片生理适应和充分利用弱光的能力（Song et al., 2016）。遮光处理显著降低了枝条中的淀粉含量，表明了本研究中处理的强度较大。一些相对温和的延迟成熟技术，例如去除叶子或施用抗蒸腾剂，对可溶性糖或淀粉储存的影响不大（Palliotti et al., 2014）。

 

  由于遮光处理中的净同化速率低于对照处理，遮光处理显着降低了浆果可溶性固形物含量。对照处理的浆果可滴定酸在发育阶段低于遮光处理，Martínez-Lüscher等（2016）也发现了相同的结果。对照处理的果穗比遮光处理的果穗承受更多的高温胁迫。之前的研究表明，随着温度的升高，葡萄中的酒石酸和苹果酸浓度降低（Bergqvist et al., 2001）。在我们的研究中，虽然遮光处理下的收获日期推迟了15天，但葡萄酒的酒精含量并没有增加，甚至低于对照，这证明遮光处理在克服全球变暖导致的高酒精度问题方面是有效的。

 

  遮光处理的果实中花色苷浓度的增加可能是由于浆果重量的减少，因为遮光处理和对照组的每粒果实中花色苷的含量没有显著差异。尽管普遍的观点认为增加曝光会导致花色苷生物合成的增强，但当温度增加到某一程度时会对花色苷合成产生负面影响(Joscelyne et., 2007)。在我们的研究中，太阳辐射的减弱对对遮光处理组花色苷的合成是不利的，但比对照更少的高温胁迫有利于花色苷的合成，两种效果综合作用后，每个果实中花色苷含量无显著差异。但是遮光处理组果实和葡萄酒中的黄酮醇含量有所下降。众所周知，黄酮醇的主要作用是能够作为紫外线过滤器吸收280~330 nm的光，以此来保护植物组织免受紫外线伤害（Price et al., 1995）。在我们的研究中，遮光处理降低了槲皮素和其他黄酮醇，尤其是山奈酚的含量。与对照组相比，遮光处理导致葡萄中槲皮素浓度降低46%，山奈酚降低87%。遮荫和对照的果实在采收期具有相似的原花青素水平。遮荫对单宁水平的影响可能与品种有关。对‘西拉’进行遮光处理并未对葡萄中的单宁含量造成影响，而在黑比诺中，遮荫处理的的果实中单宁水平较低(Downey et al., 2004; Cortell and Kennedy, 2006)。遮光处理果实所酿葡萄酒色度较低，这可能是因为遮光处理葡萄果实中的黄酮醇和黄烷-3-醇浓度低于对照组，这些是花色苷的辅色必不可少的物质，可以改善葡萄酒的颜色和稳定性。此外，较高的pH值也会对遮光处理果实所酿葡萄酒的颜色产生负面影响。

 

  5.结论

 

  部分叶幕遮光作为延缓葡萄成熟的常用手段，在本研究中可延缓赤霞珠成熟两周左右，但同时也造成了叶片净同化速率的降低进而影响产量。葡萄和葡萄酒中的酚类物质受遮光处理的影响显著，包括花色苷浓度的升高和黄酮醇浓度的降低。遮光处理对葡萄酒香气的改善是显著的，提高了葡萄酒的花香、果香和焦糖香。但遮光处理对葡萄酒的颜色是有负面作用的。在之后的研究中，可以适当调整遮光时间来避免遮光处理对葡萄酒的不利影响。