石家庄综合试验站

  葡萄果实具有经济效益高，食用美味等特点，广受果农与消费者喜爱。除鲜食外，葡萄还能够加工为葡萄酒、葡萄干及葡萄汁等产品，具有较高经济价值。迄今为止，我国鲜食葡萄产量与面积均居世界首位，随着葡萄产业发展，我国葡萄的产量与栽培面积依然在逐年增加。

  葡萄酚类物质，广泛存在于果实、叶片与枝条组织，是赋予果皮与葡萄酒颜色，给予葡萄酒骨架感的主要成分。近年来，随着我国葡萄与葡萄酒产业迅猛发展，一些具有生物价值的葡萄皮渣或非商品果被随意丢弃，所造成的资源浪费及环境问题愈加显现，而这些废弃物中普遍含有的酚类物质，具有抗氧化、延缓衰老、抗癌、预防心脑血管疾病等多种功能，所以在食品、医药保健品及日化用品领域有着广泛应用价值。鉴于此，通过梳理葡萄果实中酚类物质的种类、含量、合成、提取及应用等方面的研究进展，以期为葡萄果实中酚类物质的研究与综合应用给予参考。

  1.葡萄果实中酚类物质的种类研究

  分子中含有酚官能团的物质可称为酚类，结构上，可将酚类物质分为类黄酮类及非类黄酮类，葡萄果实中，类黄酮类主要以花色苷、黄烷醇及黄酮醇等形式存在，而非类黄酮类主要以酚酸形式存在，此外，单宁作为酚类多聚物广泛存在于葡萄中。

  作为葡萄果实中重要次级代谢产物，酚类物质在葡萄果实中种类繁多。Peixoto等人在葡萄皮渣中分离到28种酚类形式的物质，其中含11种黄烷醇类，7种花色苷类，6种黄酮醇类，2种羟基苯甲酸类和2种羟基肉桂酸衍生物类。Milini等人在普罗库帕茨葡萄中鉴定出75种酚类物质，包括18种花色苷类、13种羟基苯甲酸及其衍生物类、6种羟基肉桂酸类、13种黄烷醇类、16种黄酮醇类及9种芪类物质。不同葡萄品种酚类物质种类差异较大，张娟等人发现，不同品种葡萄果肉含有单体酚种类不尽相同，如被试的20个葡萄品种，除沙多内、粉红沙斯拉与佳丽酿，其他17个品种均含咖啡酸；除沙多内、法国蓝与蛇龙珠外，其他17个品种未检测出儿茶素。

  葡萄种籽、果皮及果肉组织中酚类物质的种类差别较大。Pantelic等人报道指出，种籽中酚类物质主要以黄烷醇类形式存在，且种间也存在差异，如儿茶素没食子酸、儿茶素及表儿茶素分别是灰比诺、普罗库帕茨和赤霞珠种籽的主要黄烷醇类物质。果皮中以黄酮醇类物质为主，其中，槲皮素为黄酮醇类物质的主要存在形式，西伯利亚落叶松黄酮、杨梅酮及丁香亭则是有色品种典型的黄酮醇类物质。花色苷类主要存在于葡萄果皮，liang等人在110种葡萄果皮中共发现了29种花色苷类物质，且品种间差异较为显著。果肉中羟基苯甲酸类是酚类物质主要存在形式，而黄酮醇类物质含量甚微。

  2.葡萄果实中酚类物质含量研究

  由于葡萄品种间果实中酚类物质含量存在较大差异，所以在探讨葡萄果实酚类物质含量时需结合葡萄品种。Xia等人对31种葡萄进行检测，结果表明，被试品种种籽中总酚变动范围为12.28-95.23 mg GAE/g DW(GAE：没食子酸，DW：干重)，其中赤霞珠、玫瑰香、梅洛葡萄总酚含量最高，均可达90 mg GAE/g DW以上，而葡萄果皮中酚类物质含量呈现东方品种高于欧亚种的特点，其中总黄酮含量最高为桑叶葡萄35.13 mg RAE/g DW（RAE：芦丁），最低为马雷夏尔福煦葡萄4.8 mg RAE/g DW，黄烷醇含量最高为阿尔登葡萄19.41 mg PAE/g DW（PAE：原花青素），最低为野生葡萄长白九1.9 mg PAE/g DW。报道指出，有色葡萄品种果皮中酚类含量普遍高于无色品种。Katalinic等人对不同颜色葡萄果实的白藜芦醇进行测定，发现有色葡萄品种中白藜芦醇含量大概率高于无色品种，分别为0.37～2.15 mg·kg-1与0.20～1.11 mg·kg-1。王美丽等人对梅洛、黑比诺及霞多丽中6种单体酚物质进行测定，发现被试单体酚含量由高到低分别为儿茶素、安息香酸、没食子酸、芦丁、丁香酸、阿魏酸，且在梅洛与黑比诺中以上物质含量均高于霞多丽。黄烷醇作为种籽中主要酚类物质，在不同品种中其含量同样存在一定差异，Pantelic等研究表明，儿茶素没食子酸是黑比诺种籽中含量最高的黄烷醇类物质（1454.60 mg/kg DW），而在赤霞珠种籽中则为表儿茶素（511.54 mg/kg DW）。

  葡萄种籽、果皮及果肉组织中酚类物质的含量也存在较大差异，研究表明，种籽与果皮中酚类物质含量远高于果肉，Sandhu等对8种圆叶葡萄不同组织中检测发现，总酚含量由高到底，依次为种籽（27-81.2 mg GAE/g），果皮（4.3-10.2 mg GAE/g），果肉（0.3-1.2 mg GAE/g）。Yu等对22种欧亚种葡萄检测发现，这些葡萄种籽、果皮及果肉中总酚含量分别为1.62-3.26 mg GAE/g FW、0.97-1.67 mg GAE/g FW及 0.09- 0.62 mg GAE/g FW。除在葡萄品种间与组织部位酚类物质的成分与含量存在较大差异外，还与葡萄栽培地区的风土、栽培模式、管理水平及葡萄成熟度等息息相关。

  3.葡萄果实中酚类物质生物合成过程研究

  植物的多种代谢过程都涉及酚类物质的合成，其中莽草酸途径是合成酚类物质的首要途径。通过糖酵解途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）以及通过磷酸戊糖途径产生的4-磷酸赤藓糖（E4P），经由7-磷酸-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸酶（DAHP）催化后可进入莽草酸途径生成苯丙氨酸，而苯丙氨酸再经过苯丙烷代谢途径可合成4-香豆酰-CoA，在这一过程中可同时产生多种酚酸类物质。随后，4-香豆酰-CoA经类黄酮代谢途径与丙二酰-CoA在查尔酮合酶（CHS）及查尔酮异构酶（CHI）等酶催化下逐步生成二氢黄酮类化合物，该化合物作为黄酮类的前体物质，可经其他分支途径逐步生成黄酮醇、黄烷醇及花青素等。

  在葡萄酚类物质合成过程中，许多酶类发挥重要功能。经由莽草酸途径合成的苯丙氨酸，首先要经苯丙氨酸解氨酶（PAL）脱氨催化后形成酚类前体物质反式肉桂酸，所以PAL是植物合成酚类物质的首个限速酶。经生物信息学分析，发现葡萄基因组共含17个PAL基因，其中VviPAL2与VviPAL15在葡萄各个组织中表达量较高，且与酚类物质积累规律一致。在葡萄贮藏期间，利用N2O对木纳格葡萄进行处理，可上调表达12个PAL基因，同时增强葡萄果实的苯丙氨酸代谢活性，从而提高葡萄果实中酚类物质含量。 此外，CHS是类黄酮合成途径中第一个关键限速酶，除了能够催化底物生成4,5,7-三羟基黄烷酮外，也是合成白藜芦醇的重要酶。袁华招等人通过生物信息学分析，发现葡萄中共有9个CHS基因。Wang通过对赤霞珠CHS进行研究发现，CHS主要分布在葡萄果实、叶片、茎尖及茎的韧皮部，并且CHS活性的提高与类黄酮含量积累过程一致。在果实发育过程中，CHS主要分布在果皮与维管束中，定位于细胞质、细胞核、细胞壁、叶绿体、色质体及粗面内质网中。除PAL与CHS外，还存在很多参与葡萄酚类物质合成的重要基因，如CHI、F3H、ANS、LAR等，目前这些基因也多作为标记基因，用来在分子层面分析葡萄酚类物质变动原因。

  近几年，越来越多的转录因子被揭示参与葡萄酚类物质合成过程，其中，研究最广泛的是R2R3-MYB类。通过基因共表达网络分析发现，植物R2R3-MYB家族中有44个基因可参与次级代谢，通过对不同次级代谢途径分析发现，这其中许多MYB可参与类黄酮途径。VvMYBF1已被证明可以通过调控VvFLS1的表达参与黄酮醇合成，转VvMYBF1拟南芥myb12突变体株系可以恢复黄酮醇缺陷表型，异源过表达VvMYBF1拟南芥株系可提高植株总类黄酮含量。将VvMYB5b及VvMYBA1转化于牵牛花an2突变体中，可以提高花瓣中花青素含量从而促进着色，并且，异源表达VvMYB5a可提高烟草花瓣着色程度。葡萄中并不是所有的R2R3-MYB都发挥正调控作用，Zhu等人报道指出，异源表达VvMYBC2L2可下调CHS、DFR、LAR及UFGT的转录水平，从而降低烟草花瓣着色，说明VvMYBC2L2在花青素生物合成中起负调控作用。基于生物信息学分析，推测葡萄R2R3-MYB转录因子可识别的顺式作用元件可能有三种类型：CNGTTR、TNGTTR和CCWAMC。除MYB类，葡萄中还有很多类型的转录因子可参与酚类物质合成，如VvWRKY26可调控原花青素的生物合成，VvibZIPC22可参与调控类黄酮途径，VvMYC1可与VvMYB5a, VvMYB5b, VvMYBA1/A2及VvMYBPA1存在相互作用，从而调控类黄酮途径中花青素与原花青素合成。

  4.葡萄果实中酚类物质提取方法研究

  葡萄果实中酚类物质提取的研究多集中在葡萄皮渣中，这主要是由于葡萄加工领域尤其是酿酒业不断发展，含有一定生物价值的皮渣废料亟需通过一种有效途径进行回收利用。目前，针对葡萄皮渣酚类物质的提取方法多样，除主要的溶剂与超临界流体提取法外，还有许多如超声、微波及酶解等辅助提取法。

  在研究提取葡萄酚类物质过程中，尝用到的经典手段是溶剂提取法。具有多羟基的酚类物质易溶于水、醇类、醚类等溶剂，基于此，针对该方法的探讨多集中在料液比、溶剂比例、浸提温度与时间等，由于涉及到提取效率与产品无害性，目前多采用酒精作为溶剂进行提取。如Porto等人利用响应面方法，分别以葡萄皮渣中总酚、总花青素、总单宁含量为响应值，优化了酒精溶剂含量、料液比及提取时间。超临界流体提取法主要是利用当压强达到110 psi后31.7ºC时，CO2呈现出既具有液体溶解性也具有气体流动性的特点，此外，还具有无毒、廉价、不易燃、提取效率高、且温度低等特点，在提取酚类物质方面具有很大优势。另外还有一些辅助提取方法，如超声波、酶解及微波等辅助提取法常常用于葡萄中酚类物质的提取过程，这些方法通过利用物理或生物分解方式将物料细胞组织破坏，利于细胞内溶物释放，从而提高酚类物质提取效率。除上述方法外膜技术提取法、离子沉淀法等也常常用于葡萄酚类物质提取过程中。

  5.葡萄酚类物质的应用研究

  在酚类物质中，酚羟基及还原酮结构可抑制活性氧的活性，并且酚类物质的邻位二酚羟基可鏊合金属离子，使其丧失对氧化反应的催化能力，这就使得酚类化合物具备较强抗氧化性。此外，酚类物质还具有较强的抗氧化、延缓衰老、抗癌、预防心脑血管疾病等多种功能。基于此，葡萄酚类物质在食品加工、医药保健品及日化领域中具有广泛应用价值。

  食品领域中，酚类物质被美国食品药品管理委员会认定为安全的天然化合物，具有较强抑菌性与抗氧化性。目前该类物质多以防腐剂、抗氧化剂的形式用于食品领域。如通过检测鱼的品质与菌落数量等指标，发现葡萄多酚处理可改善鱼制品贮藏品质与时间。利用葡萄酚类物质处理，可抑制发酵成熟期火腿中脂质成分氧化、降低烤肉中致癌物多环芳烃积累、延长水果货架期等作用。葡萄酚类物质也常作为功能性物质，用以生产强化食品或饮品，如利用葡萄籽多酚开发强化蛋糕。葡萄酚类物质还可添加到饲料中改善家禽体质，汪水平等人研究发现，在兔饲料中添加原花青素后可有效增强肉兔机体的抗氧化功能，改善脂质、糖与氮代谢。在日化领域方面，由于酚类物质具有美白皮肤、防紫外线、保湿、抗皱等方面作用，所以该物质多以护肤品形式广泛应用于日化领域。Sharif等人将汉堡麝香葡萄皮与籽提取物制成乳霜，贴于成年男性面部8周后发现，提取物可有效抑制皮肤黑色素积累。Yarovaya等人证明，添加葡萄籽提取物的相关护肤品，可有效预防紫外线诱导的皮肤损伤。在医药保健品领域方面，已有报道，葡萄酚类物质在预防及缓解心血管疾病、高血压、糖尿病、癌症、促进伤口愈合、消炎和防止微生物感染等方面发挥明显作用。如葡萄籽中酚类物质可以抑制或减小颈动脉斑块的体积，白藜芦醇可通过激活癌细胞自噬来达到抗肿瘤效果，另外，分子量较低的酚类物质，可以增强5-氟尿嘧啶疗法对结肠癌的疗效。因此，葡萄酚类物质保健药品的研发也是近年来的热门话题。

  6.展望

  相较其他植物，葡萄果实中酚类物质种类繁多含量丰富，是天然白藜芦醇的主要来源，这就注定了葡萄酚类物质的特殊性，不仅如此，葡萄酚类物质对决定葡萄风味、外观及葡萄酒口感能够起到关键作用。所以针对葡萄酚类物质研究一直是葡萄育种、栽培及加工方面的热点。随着分子生物学的发展，影响葡萄酚类物质合成的基因逐渐会被挖掘出来，尤其是一些功能关键的基因，可为葡萄种质改良方面提供方向。但由于葡萄酚类物质合成代谢过程的复杂性，随着研究深入，困难会逐渐增大，研究人员可以借助转录组学、蛋白组学、代谢组学结合其他生物学实验技术对这一过程进行探索。

  近年来我国葡萄与葡萄酒产业迅猛发展，随之也带来了许多问题，如产量过剩造成的葡萄滞销，栽培过程中人为或自然因素产生的非商品果及葡萄酒皮渣随意排放等，这些现象既浪费资源，也污染环境。而恰恰在这些废弃果及皮渣中富含大量酚类物质，若将上述废弃果与皮渣回收，对其中酚类物质进行提取，这无疑会带来巨大社会效益与经济效益。但值得注意的是由于葡萄及葡萄皮渣中水分含量较高，容易造成微生物污染，所以需要保证这些原料安全性。因此，原料的保存、质量的监控、及时加工，将成为这一过程中重要环节。

  虽然酚类物质具有抗氧化、抑菌剂抗癌等多种重要生理功能，但容易受外界因素影响而降解，且高温、微波辐射或碱性条件都会加速降解。这就限制了酚类物质的应用条件，所以在酚类物质产品开发过程中，如何保持酚类物质的稳定性，将成为重点研究方向。