微生物岗位

刘延琳

  近几十年来，全球气候变暖加速了葡萄的成熟，导致葡萄的含糖量、可溶性固形物含量和pH值升高，有机酸含量降低，并打破了葡萄浆果糖浓度增加和酚类化合物成熟度之间的平衡，更使得葡萄酒中的乙醇含量不断增加（Dequin et al. 2017; Rolle et al. 2018; Du et al. 2020）。葡萄酒中乙醇含量过高会造成许多不良影响。首先，发酵过程中较高的乙醇浓度通过影响酵母菌、乳酸菌等微生物的生长，导致发酵停滞或缓慢（Henderson et al. 2014）。其次，高浓度的酒精会增加葡萄酒的苦味和灼热感，掩盖某些重要挥发性芳香化合物如高级醇、酯类和萜类（Frostet al. 2015），严重影响葡萄酒的感官品质（Englezos et al. 2018）。然后，较高的酒度不利于人类的身体健康，增加肝脏负担，损害消化系统，使人们具有消极的心理情绪（Churchill and Farrell 2017）。最后，在个别国家，酒精含量高的葡萄酒会造成税收的增加（Sharma et al. 2014）。因此，适当降低葡萄酒中乙醇含量成为现代葡萄酒工业的研究热点。

  目前，人们通常利用葡萄栽培技术和物理技术降低葡萄酒中的乙醇含量（Ciani M et al. 2016; Schelezki et al. 2018），但存在成本较高、工艺操作复杂、风味物质损失严重和产生不良副产物等问题（Liguori et al. 2013）。此外，越来越多的研究者将微生物技术应用于葡萄酒的降醇研究（Varela and Varela 2019）。比如，有研究者将基因工程和适应性进化的方法应用于降醇葡萄酒，这些策略虽然能弱化酵母的乙醇合成能力，但会影响菌株的发酵性能和葡萄酒的风味物质含量（Rossouw et al. 2013），而且在转基因食品的争论中，基因修饰的酵母也无法应用于葡萄酒工业生产中。有研究发现部分非酿酒酵母具有低产乙醇的性能（Ivit et al. 2020; Canonico et al. 2019; Longo et al. 2017; Varela et al. 2017; Varela et al. 2016）。

  1.1 葡萄酒降醇的生产技术

  1.1.1 降低乙醇的栽培技术

  1.1.1.1 降低葡萄的含糖量

  葡萄酒的酒精含量主要由葡萄酒生产中所用葡萄浆果的含糖量决定。影响葡萄糖分积累的因素很多，如葡萄园选址、土壤组成、灌溉策略、砧木、葡萄品种、葡萄产量和叶面积管理等。其中最有效的策略是通过增加产量来降低葡萄的含糖量，提高芽重、降低簇间伐、选择旺盛的砧木有利于提高葡萄产量（Burcu Ozturk and Ertan Anli 2014）。在提高葡萄产量的同时，应控制其对葡萄和葡萄酒品质的潜在不利影响。

  1.1.1.2 减少叶面积

  通过减少叶面积或功能叶面积可以降低葡萄酒乙醇含量。叶面积与浆果重量（LA/FW）决定了葡萄中的糖分积累，降低 LA/FW 的比值可以减少糖分的积累，并保证单一葡萄产量（Varela et al. 2015）。在叶面积管理中，也可以通过基叶去除控制葡萄的糖积累，摘叶增加合成酚类化合物的酶活性，对酚类化合物的形成具有明显的积极影响（Poni 2014）。

  1.1.1.3 其他栽培技术

  葡萄园的土壤组成对葡萄适当成熟也很重要。酸度和矿物质是土壤组成的决定因素（Coulter 2013）。缺镁会导致葡萄延迟成熟，影响葡萄酒的香气组成。过量施氮会影响光合作用，导致葡萄产量增加，糖积累减少，果实整体品质下降。另外，在收获前的最后几周增加灌溉量（Varela et al. 2015）或在葡萄叶幕应用生长调节剂延缓葡萄成熟（Goold et al. 2017）以及管理收获时期（Bindon et al. 2014）都可以减少葡萄酒的乙醇含量。

  1.1.2 降低乙醇的物理技术

  在葡萄酒工业生产中，酿酒师们普遍采用物理策略减少乙醇生成，包括中途抑制发酵，采用葡萄糖氧化酶和稀释葡萄汁等减少葡萄或葡萄汁中的可发酵糖，利用蒸馏、萃取和反渗透等方法从原酒中去除酒精来生产低醇葡萄酒（Ciani et al. 2016）。

  1.1.2.1 减少葡萄或葡萄汁的可发酵糖

  （1）对葡萄或葡萄汁的处理

  减少葡萄浆果或葡萄汁中的含糖量有助于降低葡萄酒的乙醇含量。采摘未成熟的葡萄可以生产低醇葡萄酒，由于早期收获的葡萄酸度高，不成熟的酚类物质和味道会产生不平衡的酒味，因此酿造出的葡萄酒酸度过高，稳定性较差，成本较高，很难受到消费者的需喜爱（Zhu et al. 2020）。考虑到对风味的潜在影响，研究者将早期采收的葡萄和成熟度较好的葡萄混合发酵，既能保证葡萄酒中较低的酒精浓度又能发挥成熟葡萄的香气物质作用（Goold et al. 2016; Longo et al. 2018）。通过添加部分葡萄汁进行稀释或替代原始葡萄汁降低可发酵糖浓度，研究表明，在酒精发酵前往葡萄汁中加入一些转色时的葡萄酿造的酒或加水稀释的葡萄汁，可以降低酒度（Schelezki et al. 2018）。两种处理方式均未改变葡萄酒的色泽、酸度、单宁和葡萄酒风味，但是，加水稀释的葡萄汁会影响发酵进程。

  （2）添加葡萄糖氧化酶

  从黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶（GOX）能将葡萄糖氧化为为葡萄糖酸和过氧化氢（Tilloy et al. 2014; Varela et al. 2016）。因此，在葡萄汁中加入这种酶可以减少乙醇生产中的糖浓度。但GOX的催化需要氧气供应，过多的充入氧气会影响葡萄酒的品质。由于葡萄糖酸的产生，GOX活性导致总酸度增加，pH值略有下降，这会影响葡萄酒的感官特性（Schmidtke et al. 2012）。

  1.1.2.2 葡萄酒的脱醇处理

  通过热学（蒸馏、蒸发等）、膜技术（反渗透、渗透等）、吸收（离子交换、硅胶等）、萃取（有机溶剂萃取、超临界二氧化碳萃取等）和冷冻浓缩等方法除去发酵后葡萄酒中的乙醇。Aguera等（2010）用旋转锥形柱SCC将霞多丽葡萄酒进行蒸馏，最后去除2%（v/v）的酒精，但高级醇和酯类物质的浓度分别降低了25%和45%，而且SCC蒸馏的高成本高限制了其大规模应用（Longo et al. 2017）。在膜过滤技术中，反渗透（RO）可以浓缩葡萄汁的糖和去除葡萄酒中的乙醇，也是最常用的膜技术，它能在低温下操作，不会影响葡萄酒的香气成分（Dequin et al. 2017），Roole等（2018）利用经反渗透处理的葡萄汁酿造葡萄酒，其酒精度降低1~2%（v/v）。虽然反渗透技术能将酒精度降低到一定数值，但成本较高。因此，无论使用任何一种膜过滤技术，醇类和酯类等挥发性物质的含量都会随乙醇去除量的增加而减少，进而影响葡萄酒的风味特征（Longo et al. 2017, 2018）。

  1.1.2.3 提前终止发酵

  在发酵过程中直接添加SO2、去除酵母菌等方式终止发酵获得低醇葡萄酒，也是葡萄酒工业常用的减少乙醇生成的方法。吕文等（2012）采用超声波处理20 min的贵人香葡萄酒，再结合传统的SO2（60 mg/L）终止发酵，得到具有典型感官特性和稳定性增强的低醇葡萄酒。崔艳等（2012）利用细胞固定化发酵技术，将酵母固定在甘蔗块中，通过去除酵母载体并适当添加SO2终止发酵，从而降低乙醇含量，同时增加了葡萄酒的微生物稳定性并丰富了葡萄酒的香气。

  1.1.2.4 添加抑制剂

  近年来，一些研究者发现天然存在于食品中的物质包括糠醛、肉桂酸等在葡萄酒酒精发酵中起到不同程度的抑制作用，具有一定的降醇能力。崔艳等 （2015）在玫瑰香干白葡萄酒发酵中期中加入60 mg/L的糠醛，所酿造的葡萄酒酒精度为7.12%（v/v）。杨凯等（2020）添加250 mg/L的肉桂酸终止葡萄酒发酵，获得品质最佳和稳定性最好的降醇葡萄酒，其酒精度降低了1.78%（v/v）。

  1.1.3 降低乙醇的微生物技术

  1.1.3.1 杂交育种

  通过酵母菌之间的杂交育种，可以获得发酵特性优于亲本菌株且表型稳定性增加的杂合体（da Silva et al. 2015）。Origone等（2017）和Perez-Torrado等（2018）分别利用酿酒酵母的种间杂交、S. uvarum和S. kudriavzevii的杂合体，均能产生低含量的乙醇和高浓度的甘油。Tilloy 等（2014）将高产甘油单倍体菌株进行杂交，用于西拉葡萄酒发酵，结果表明，杂交菌株的乙醇产量降低1.30%（v/v），同时产生更多的甘油和2,3-丁二醇。da Silva等（2015）将酿酒酵母和葡萄汁酵母进行55种杂交组合，通过分析酵母动态分布、发酵特性及挥发性化合物，得出杂交种的乙醇产量比酿酒酵母降低0.30%（v/v），发酵特性优于葡萄汁酵母。

  1.1.3.2 基因工程育种

  基因工程育种的遗传变异没有物种限制，并且可以精确和系统地整合到宿主基因组中。通过基因修饰手段，对酵母代谢途径进行定向改造，能够减弱菌株的乙醇合成能力。改造乙醇代谢途径中的关键酶，如葡萄糖氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和NADH氧化酶等，可以有效减少乙醇产量，但存在甘油含量大幅度提升，导致不良代谢产物增加，从而影响葡萄酒的品质。

  （1）乙醇代谢途径

  对乙醇代谢途径进行改造是最为直接的方式。乙醇脱氢酶（由ADH1、ADH3、ADH4和ADH5基因编码）在酵母发酵中起重要作用，将乙醛还原为乙醇。研究表明缺少ADH1基因，酵母在厌氧条件下不能生长，乙醇产量减少，甘油合成增加，生长速率相对下降，酵母菌株缺乏额外的ADH基因（ADH3和ADH4）时，乙醇产量进一步下降（Varela et al. 2012）。

  丙酮酸脱羧酶催化丙酮酸脱羧成乙醛和CO2。三个丙酮酸脱羧酶基因PDC1、PDC5和PDC6在酵母发酵过程中被转录因子Pdc2p、Pdc1p、Pdc5p激活调节（Varela et al. 2018）。Cuello等（2017）构建了pdc2Δ519和pdc2Δ344突变体菌株，使葡萄酒中总乙醇含量降低了7.42%（v/v），且未造成残糖和挥发性酸的不良影响。于淼等 (2016)构建了丙酮酸脱氢酶基因敲除重组酿酒酵母Y1-2，通过发酵获得酒度为3.7%（v/v）的低醇葡萄酒。

  （2）甘油代谢途径

  甘油代谢途径改造是目前降低葡萄酒乙醇含量最为有效的方法。甘油是酵母菌的发酵副产物，在葡萄酒中的浓度范围为5~9 g/L。不仅能维持酵母中的氧化还原平衡和渗透平衡，对葡萄酒感官品质也有积极作用。其代谢途径中的两个关键基因：GPD1在渗透胁迫下被激发，GPD2在厌氧条件下被诱导，过表达编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因GPD1或GPD2，实现在葡萄酒发酵过程中乙醇产量下降（Naghshbandi et al. 2019），但甘油含量的增加导致酵母对NADH的再氧化，使不良风味物质乙酸、乙醛和乙偶姻的增加（Goold et al. 2017）。一些基因修饰包括敲除ALD6（编码乙醛脱氢酶）和过度表达BDH1（编码2,3-丁二醇脱氢酶）分别限制乙酸和乙偶姻的产生（Varela et al. 2018）。   

  （3）有机酸代谢途径

  减少乙醇产量的另一个潜在策略是将碳转向有机酸的合成，例如葡萄糖酸和涉及三羧酸（TCA）循环的酸（Varela et al. 2012）。缺失和参与TCA循环的几个基因的过表达已经显示出不仅影响的有机酸的形成也影响乙醇生产（Selecky et al. 2008）。虽然这些修饰很有前景，但它们在酿酒环境中的真正影响尚未得到探索。

  （4）其他代谢途径

  Rossouw等（2013）过度表达编码海藻糖6-磷酸合成酶的TPS1基因，由于海藻糖-6-磷酸抑制糖酵解的第一步骤中，这种策略不仅转移碳远离乙醇形成，但也有望通过糖酵解下调碳通量，工程葡萄酒菌株产生的乙醇比未修饰的菌株少1.5%（v/v）。Brandt（2013）利用果糖基转移酶（FTF）在酵母中的异源表达，将果聚糖从糖酵解和乙醇生产中转移到胞内果聚糖生产上，从而减少了生产乙醇的碳源，降低了乙醇产量。

  1.1.3.3 适应性进化

  基因工程育种有一定的局限性，因为基因工程育种酵母使葡萄酒的乙醇产量下降的同时会产生一些不必要的代谢副产物，如乙醛、乙酸和乙偶姻，严重影响葡萄酒的感官质量。为了避免这个问题，一些研究人员使用进化工程改良工业酵母（Tilloy et al. 2015; Steensels et al. 2014）。适应性实验室进化（ALE）具有改善酵母特性的巨大潜力，特别是对于遗传决定因素未知的复杂特征。Tilloy等（2014）采用基于进化的策略和育种策略，表明进化的或杂交的菌株与原始菌株相比，可以使乙醇含量降低0.6~1.3%（v/v）。然而，进化工程育种突变的效率低，可能会影响菌株的生长、耐受性、酶的稳定和催化能力等特性（Rollero et al. 2015）。