病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 张尊平 胡国君 任芳 张梦妍

  葡萄浆果内坏死病（最早称花叶病）1984年于日本巨峰葡萄上首次发现，该病在日本山梨县葡萄园造成严重危害。一些敏感品种（如巨峰、先锋、立川无核、康拜尔早生）感染该病后，植株生长减弱，春季萌芽延迟，并且表现茎内坏死、短节、花叶、果粒小，果外变色，果内坏死等症状。病株摩擦接种菎诺藜后，发现了一种大小为740×12 nm的线形病毒，命名为葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus, GINV）。GINV属发状病毒属（Trichovirus）的成员之一，其基因组由3个开放阅读框组成，分别编码复制酶（RP），移动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）。2016年，该病毒在我国葡萄上首次报道，并初步表明GINV与葡萄表现褪绿斑驳和环斑症状发生相关。对来自我国15个省（市）自治区的195个葡萄样品进行GINV检测，带毒率为35.9%，其中，表现明显环斑症状的葡萄带毒率为94.1%。检测结果虽然显示GINV与一些葡萄褪绿斑驳及环斑症状相关，但目前仍缺乏直接证据证明GINV是褪绿斑驳和环斑病的病原。

  葡萄病毒在田间多复合侵染，因此，很难将一种葡萄病毒与某一特定的症状直接联系起来。对于一些新的葡萄病毒，往往通过田间症状观察、大量样品的病毒检测、病毒序列分析、嫁接传毒实验等研究，来明确病毒与田间症状的相关性。由于葡萄病毒均难纯培养，很难完成柯赫氏法则的第三条规则（即将纯培养接种到相同品种的健康植株上，出现症状相同的病害），因此，大部分葡萄病毒与某一病害之间的关系均没有直接的证据证明。前人已有报道许多植物病毒采用病毒全长cDNA克隆接种的方式完成了柯赫氏法则第三条规则。为此，本研究构建了GINV全长cDNA侵染性克隆，并成功接种烟草和葡萄，证明了GINV是引起葡萄褪绿斑驳和环斑病毒的病原，具有重要理论和实践意义。

  1 方法

  1.1 侵染性克隆构建

  GINV基因组PCR扩增。采用设计的引物分别扩增GINV分离物LN_BETA两端序列。此引物设计可使扩增产物之间有17nt重叠区域，又分别与载体pCB301两端序列有20nt重叠区域。扩增采用NEB公司的高保真扩增试剂盒进行，扩增产物通过回收试剂盒进行纯化回收。

  GINV扩增片段与pCB301载体进行重组连接。采用限制性内切酶Stu I和Sma I对回收纯化的pCB301载体进行酶切，经 1% 的琼脂糖凝胶电泳分离，回收。利用无缝克隆试剂盒，将双酶切的 pCB301载体与GINV全基因组的 2 个扩增片段在50度连接1h。连接完成后，将连接产物通过热激法转化大肠杆菌 DH5ɑ，涂布在含有 kan 抗生素的平板上，37℃培养，筛选含有GINV的全长基因的载体。 将获得阳性克隆质粒转化农杆菌EHA105。

  1.2 侵染性克隆接种西方烟草和贝达葡萄

  接种烟草时，将含阳性单克隆的农杆菌接种到含有Km（50μg/ml）和Rif（50μg/ml）的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的摇床上摇菌培养至OD600为1.0左右，经8000rpm 10min离心收集沉淀，采用含有终浓度为10mM MgCl2，10mM MES，100μmM的乙酰丁香酮的接种液溶解沉淀，并调整 OD600至1.0。静置4-5h后，通过注射器接种4叶期的西方烟苗叶片，使接种液冲满整个叶片，每株烟草接种两片叶片。接种后每天观察发病情况，一周后采用PCR对接种后的烟草进行鉴定。另外，通过电镜观察确定侵染性克隆接种后形成的病毒粒子。

  接种葡萄时，用含100uM乙酰丁香酮（AS）的1/2MS培养基（含1mg/L BA和 0.5mg/L NAA）溶解农杆菌沉淀，调OD值约为1.0，超净工作台上分装至试管中，每个试管约20ml。用接种针扎刺葡萄组培苗根，每个根扎2个部位，滤纸固定于试管中，使根部完全浸入液体中，放置在光照培养室培养。10天后，转入新鲜的MS液体培养基，再培养15天。之后，转移到含500 mg/L头孢噻肟（sigma 0.6g溶于12ml无菌水）的新鲜MS固体培养基中，放置在光照培养室。经PCR鉴定为GINV阳性的组培苗，进行移栽。移栽后每天观察发病情况。

  2 结果

  2.1 侵染性克隆构建

  采用两对引物分别扩增获得对应GINV基因组位置1-4978和4962-7229两段序列（图1a），与Stu I和Sma IS双酶切的PCB301载体进行连接。连接产物转化农杆菌后，采用GINVMP1A/1B和GINVCP1A/1B两对引物对阳性克隆进行PCR鉴定。同时对重组质粒进行了SmaI酶切，酶切产物电泳显示在10000bp和15000之间出现一条的条带（图1b）。PCR和酶切鉴定结果表明重组质粒为阳性克隆质粒pGINV-1，结构图见图1c。阳性克隆质粒进一步转化农杆菌EHA105感受态细胞。

  2.2 草本接种结果

  通过农杆菌注射法将构建的GINV侵染性克隆接种西方烟，9天后西方烟表现明显的褪绿斑驳症状（图2a）。为进一步证实GINV侵染性克隆接种成功，采用GINVCP1A/1B和GINVMP1A/1B对20棵表现症状的西方烟草进行了PCR鉴定，结果显示20棵烟草中均能扩增出GINV的特异性条带（图2b）。为验证GINV侵染性克隆侵染后是否形成病毒粒子，对显症烟草进行了电镜观察，结果，显症烟草中可以观察到GINV病毒粒子（图2c）。上述实验表明构建的侵染性克隆具有侵染活性。

  2.3 葡萄接种结果

  通过农杆菌浸染组培苗根的方法将构建的侵染性克隆接种贝达葡萄组培苗，对接种成活的葡萄苗进行PCR鉴定，结果显示，部分组培苗已感染GINV。将接种成活的10棵组培苗移栽至田间，三个月后，侵染性克隆接种的贝达葡萄表现明显的褪绿斑驳症状（图3a）。经病毒检测，成活的7棵贝达葡萄中4棵检测为阳性（图3b）。第二年春季，接种的贝达新生葡萄叶片表现出环斑症状（图3b）。