果实病害防控岗位

  葡萄斑点病（grapevine fleckdisease）在世界各地普遍发生。该病常导致葡萄叶片出现黄色斑块或斑点、叶片皱缩、扭曲、向上反卷。葡萄斑点病毒(Grapevine fleckvirus ，GFkV)是与该病相关的病原物。GFkV为芜菁黄花叶病毒科family Tymoviridae )葡萄斑点病毒属(gneus Maculavirus )成员。我国行业标准“NY/T1843-2010葡萄无病毒母本树和苗木”规定该病毒是应检对象。我们建立了GFkV的RT-PCR检测方法，可以简单、快速和经济地检测该病毒。

  1　实验材料、试剂与用具

  1.1　植物材料

  葡萄叶柄。

  1.2　试剂和仪器

  E A S Y s p i n 植物 RNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒（PrimeScript® RT reagent Kit,TaKaRa）、TaKaRa TaqTM DNA 聚合酶、dNTP Mixture （2.5mMe a c h ） 、双蒸水（ddH2O） 、50×TAE 电泳缓冲液（2M Tris-醋酸，100mM EDTA；配制100 mL：Tris 24.2 g，0.5 M EDTA(PH8.0)10mL，冰乙酸 5.7mL，去离子水定容到100mL。电泳时将其稀释50倍）、液氮、GoldViewTM 核酸染料、DNA分子量大小（DL2000DNA Marker）及其附带的DNA电泳上样缓冲液（ 6 ×Load ingBuffer）。

  PCR仪、微量台式冷冻离心机、电热恒温水槽、涡旋混合器、微量紫外/可见分光光度计、微波炉、天平、凝胶成像仪、灭菌锅、移液器、电泳仪、水平电泳槽、制胶架、凝胶板、加样梳、烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、Tip头、一次性手套和口罩、研钵。

  1.3　检测引物

  正向引物C P - F ：5′-GTGTAAGCATCCATCTCCCCTTCCAG -3′

  反向引物C P - R ：5′-GAGTCGATGGTCCAGCAGAGGTC′。

  PCR扩增产物是GFkV的CP基因部分序列，长度210bp。

  2　实验方法

  2.1　总RNA提取

  取3-5个叶柄，用镊子剥下其外皮（韧皮部组织），混合后称取0.1 g~0.2 g放入研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末。将粉末转移到1.5 mL离心管，按照EASYspin植物 RNA 快速提取试剂盒的操作步骤提取总RNA。用微量紫外/可见分光光度计测定RNA浓度。

  2.2　反转录

  将反转录试剂盒（PrimeScript®RT reagent Kit, TaKaRa）中组分及提取的RNA按表所示加入1.5 mL 离心管，混匀：

  将离心管放在42℃ 恒温水槽中1 小时（h）后获得cDNA。

  2.3　PCR扩增

  反转录后即进行 PCR 扩增，在 0.2mL 离心管中加入下列组分：

  混匀后将离心管放在PCR仪进行反应。PCR 反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性 20s，63.0℃退火30 s，72℃延伸20s，35个循环；72℃ 延伸5min。反应结束后取出。

  2.4　琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

  （1） 制备琼脂糖凝胶溶液（浓度为1.0%） ： 称取琼脂糖0.2g，加入1 ×TAE电泳缓冲液20mL，盖上封口膜，振荡后置微波炉中将琼脂糖充分融化，取出后加入适量GoldViewTM核酸染料（每100mL凝胶中加入2~5μL核酸染料）并轻摇混匀。

  （2）凝胶的制备：将凝胶板置于制胶架中，插上加样梳，待胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入凝胶板上，除掉气泡。待凝胶冷却凝固后，垂直轻轻拔出梳子后将凝胶放入电泳槽内，加入1×TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液的液面略高出琼脂糖凝胶面。

  （3） 加样： 在薄膜上混合PCR产物（5μL，约0.5~1μg）和上样缓冲液（1μL）。用微量移液器分别将样品和DNA Marker加入琼脂糖凝胶的加样孔内，每加完一个样品，应更换一个Tip头，以防污染，加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶。注意：加样前要先记下加样的顺序。

  （4）电泳：加样后，将电泳槽立即通电进行电泳，调节到合适电压（5V/cm）。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

  （5） 观察和拍照： 电泳完毕，取出凝胶。在凝胶成像仪下观察是否出现目的条带（约210bp）并拍照。如果有目的条带，说明样品中很可能感染了GFkV。