鲜食葡萄栽培岗位

魏玲玲 王武 郑焕 陶建敏

 

  摘　要：[目的]探究单穗不同留果量对‘阳光玫瑰’葡萄果实品质、香气物质及相关基因表达的影响。[方法]以‘阳光玫瑰’葡萄为材料，花后一周进行疏果处理，分别留有L40、L60、L80。应用GC-MS定量定性分析不同发育阶段葡萄果实中香气成分及含量，应用实时荧光定量PCR技术研究不同发育阶段果实香气合成相关基因表达水平。[结果]不同留果量处理对葡萄果实外观品质影响明显，L40穗形美观、果粒饱满、色泽均匀，L60果粒较小、穗形不紧凑，L80成熟不一致且杂含大小果。三种处理间的可溶性固形物含量差异不明显，L40的可滴定酸含量显著低于其余处理。在果实成熟期，C6化合物含量在L60果实中较高；萜烯类物质在L40果实中含量较高，其中芳樟醇含量明显高于L60、L80。L40处理较其他处理其果实中各种萜烯物质含量下降更慢，某些萜烯类物质如顺式氧化芳樟醇、香茅醇保留时间更长。萜烯物质合成相关基因转录分析表明，VvDXS 转录表达受留果量处理影响明显，且与萜烯类物质总量呈相关关系。L40果实其VvDXS 表达整体趋势高于其他处理。[结论]研究结果表明，L40留果量处理有利于葡萄果实发育后期香气物质积累及保存，并且明显改善果实外观品质。

 

  关键词：葡萄；留果量；果实品质；香味；基因表达

 

  ‘阳关玫瑰’（Vitis labruscanaBailey × Vitis vinifera L .）属二倍体欧美杂交葡萄新品种，亲本为‘安芸津21号’和‘白南’。因其外形美观、皮薄可食、肉脆多汁、玫瑰香味浓郁、生产上易于栽培等特点，近几年来受到了广泛的关注。风味是衡量葡萄果实品质一个非常重要的指标，其中香气是果实风味的一个重要组成部分。香气是一个相对复杂的性状，其是由多种挥发性化合物共同构成的，对于某些品种来说，其特征香气物质是独一无二的并对果实的香气类型起决定性作用。果实中特征香气物质的确定取决于其在果实中的浓度以及其感知阈值。不同挥发性化合物所表现出的香气特征有着明显的差异，因此其在不同品种中的含量及组成也有着很大不同。

 

  ‘阳光玫瑰’葡萄属于玫瑰香型品种，其具有非常浓郁的麝香味。麝香葡萄中主要的挥发性化合物为通过萜烯类代谢途径合成的芳樟醇、橙花醇和香叶醇，其中芳樟醇的感知阈值最低,对葡萄果实的玫瑰香味贡献值最大。此外葡萄果实中还包括由脂肪酸代谢途径产生的醛类、醇类、酮类等C6/C9挥发性化合物，这些单穗不同留果量对‘阳光玫瑰’葡萄果实品质及香气物质积累的影响物质的阈值虽然很高，但个别物质（如己醛、己烯醛等）在果实中的含量也极高，这些挥发性化合物对构成葡萄果实草香味发挥着重要的作用。

 

  在上述两条代谢途径中，会涉及到多种关键酶。2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-methyl-D-erythritol-

4-phosphate，MEP）途径主要由上游途径限速酶脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（Deoxyxylulose 5-phosphatesynthase ，DXS）、5-磷酸-脱氧木酮糖还原异构酶（Deoxyxylulose5 - p h o s p h a t e s y n t h a s ereductoisomerase， DXR）、1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸还原酶（1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl4-diphosphate reductase ，HDR），中游途径限速酶香叶基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）和下游萜烯合酶（萜烯合酶，TPS）共同调控的。芳樟醇/橙花醇合成酶基因是TPSs中一员，其表达水平被认为与葡萄果实单萜物质积累显著相关。脂肪酸代谢途径中的相关限速酶为脂氧合酶（lipoxygenase，LoX）、脱氢氧化裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）、醇脱氢酶（ADH）、醇酰基转移酶（AAT）。同样地，这些基因的表达水平也被认为与果实中C6/C9化合物含量成相关关系。

 

  疏花疏果处理是葡萄生产管理过程中不可或缺的一个环节，其通过改变负载量影响库源关系，进而影响果实品质及产量。合理进行疏花疏果不仅可促进果粒大小均匀，着色度好，穗型整齐，成熟一致等，还可提高其商品价值，带来经济效益。有研究表明，葡萄植株负载量变化显著影响果实品质和风味。产量过高会导致果实可溶性固形物含量降低，酸度偏高，香气及风味物质含量减少。产量过低又会影响整体经济效益，导致营养生长过旺而不利于果实的生长发育。因

此，合理进行疏花疏果处理是提高果实品质非常重要的措施之一。

 

  目前，国内外更多的试验研究是针对于亩产产量对果实风味品质的影响，然而具体到单穗不同留果量对品质的影响则鲜有报道。本实验采用单穗40粒、60粒、80粒不同留果量处理，研究‘阳光玫瑰’葡萄果实中香气物质合成及相关基因的转录变化规律，以期为指导田间实践、改善果实风味品质提供理论依据。

 

  1　材料与方法

 

  1.1　材料

 

  试验于2017年和2018年在南京农业大学汤山葡萄试验基地进行。平架棚“H”型整形，选择避雨栽培，株行距为8.0×6.0m。以8年生‘阳光玫瑰’葡萄为试验材料，选择树势一致，生长正常的植株，栽培管理措施同常规。盛花期用25mgL-1GA3 + 5mgL-1 CPPU处理果穗，盛花后两周用25mgL-1GA3处理。盛花后一周进行疏果处理，疏去畸形果、发育较小果以及排列过密的果粒，最终分别保留40粒、60粒、80粒，分别用L40、L60、L80表示。每个处理3棵树，每个枝条上只保留一串果穗。

 

  1.2　方法

 

  （1）样品采集 从盛花后8周开始采集样品，每隔两周采集一次，采样时果穗上中下位置果粒均等采集，每次采集90-100粒，分为三个生物学重复。样品采完后立即放入冰盒中，带回实验室留有一部分进行生理指标测定，其余样品放入超低温-70℃冰箱保存以备后续实验。

 

  （2）果实品质测定 于成熟期（花后16周）进行果实品质测定。使用游标卡尺测量单个果实纵横径；使用电子天平测定20-30个果实重量，分三次重复，进而计算单果重；使用PAL-1便携式数显折光仪测定单个果实的可溶性固形物含量；采用常规酸碱中和滴定法测定果实中可滴定酸含量。

 

  （3）总RNA的提取以及荧光定量PCR 使用植物总RNA提取试剂盒（Bioteke，Beijing，China）提取果实总RNA。以总RNA为模板，使用Takara Prime ScriptTMRTPCR试剂盒反转录合成cDNA。内参基因为VviUbiquitin ， qRT-PCR引物由Beacon Designer 7（PREMIERBioso f t 公司）设计。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR20μL反应体系为：TakaraSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL，上游引物和下游引物各0.5μL，稀释至250 ug•ml-1的 cDNA1μL和8μL去离子水。反应程序如下：95℃预变性4 min，95℃变性20s，L60℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。

 

  （4）果实香气物质测定 果实香气物质含量测定参考王继源等方法，并作轻微改动。将每份重复样品进行去果柄和种籽，用液氮研磨后，取8g置于20ml顶空瓶中，加入磁力搅拌子、1.0gNaCl和10μL20ng/μL的3-辛醇（内标）。50℃下平衡30min，萃取30min，磁力搅拌子转速800r•min-1。250℃下解离5min。升温程序：40 ℃保持5分钟，然后以2℃/min升至1L60℃，保持2分钟，以10℃升至220℃，保持1min。载气为氦气，不分流。色谱柱：DB Wax（30.0m×250μm×0.25μm）。萃取头为50/30μm PDMS/DVB/CAR SPME。

 

 

  1.3　数据处理

 

  质谱图采用标准谱库NIST/WILEY和相关文献确定峰保留时间进行定性分析，定量分析则采用峰面积归一法。采用SPSS17.0、Excel进行统计学分析，采用LSD检验进行显著性方差分析（p≤ 0.05）。

 

  2　结果与分析

 

  2.1　不同留果量处理对果实品质的影响

 

 

 

  表2为成熟期不同处理的可溶性固形物、可滴定酸、纵横径、单果重等生理指标。结合图1可以看出不同留果量处理对葡萄果实外观品质的影响明显。L40穗形美观，果粒紧凑饱满，果实色泽均匀；L80果粒偏小，杂含大小果，果实色泽不均匀；L60果实外观品质置于L40和L80处理之间。由此可知，过多留果量会影响果实的外在品质，不利于美观。内在品质方面，各处理间的差异不显著。在2017和2018年间，L40果实可溶性固形物含量最高，与其余两处理的差异不显著。L40果实可滴定酸含量显著低于L60、L80。

 

  2.2　不同留果量处理对葡萄果实

 

  主要香气物质组分及含量的影响从花后第8 周开始， 每隔两周，对2017和2018两年间不同留果量处理的葡萄果实进行香气物质组分及含量测定，结果如下表3。表3中列举了果实中含量最高的前四种直链脂肪酸化合物，分别为己醛、2-己烯醛、3-己烯-1-醇、1-己醇；表4中列举了全部的萜烯类化合物，分别为芳樟醇、香叶醇、萜品醇、橙花醇、顺式氧化芳樟醇、去氢芳樟醇、香茅醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮。由表3可以看出，随着葡萄果实不断发育成熟，果实中的芳香物质总含量不断升高，但各香气物质组分的发展趋势有差异。

 

  C6化合物在果实香气成分中占有很高的比例，尤其是己醛和2-己烯醛，随着果实不断发育其含量呈明显上升趋势，但在2018年花后16周呈下降趋势。2017和2018年，L60果实己醛含量总体上高于其他两个处理，L40高于L80。2-己烯醛含量变化同己醛先升高后降低的规律相似，L60含量显著高于L40和L80。3-己烯-1-醇和1-己醇在果实中的含量比己醛和2-己烯醛低很多，并且各处理间含量变化规律与己醛和己烯醛差异较大。在果实发育成熟期，2017年L40果实中3-己烯-1-醇和1-己醇含量显著高于其余处理，但在2018年，L60其两者含量显著更高。

 

  果实达成熟期，L40果实中萜烯总含量显著高于其余处理，L60和L80于花后14周达最大值，之后下降。芳樟醇在萜烯类物质中占有比例很高，其含量随着果实成熟逐步升高。花后第8周，果实中的芳樟醇开始逐步合成，2017年的L40和2018年的L40及L60果实中未检测到芳樟醇。在2017年，L40果实中芳樟醇含量逐步上升，于成熟期达最高，L60和L80于花后14周达最高值，随后下降；在2018年，三种处理均是于花后16周达最高值，且L40果实其含量增长速度最快。果实中香叶醇含量同样随果实发育呈上升趋势，于成熟期L40处理其含量显著高于其他处理。

 

  萜品醇只在2017年的果实中被检测到，在L40果实其含量逐步上升，在L60和L80实中检测到，在发育后期L40果实中其含量要高于其余处理。与此相反的，香茅醇则只在2018年的果实中检测到，L40果实其含量逐步上升，L60和L80于花后14周达最高值随后下降。

 

  2.3　不同留果量处理对葡萄果实

 

图2　不同处理对香气相关基因表达的影响

 

  香气合成相关基因表达的影响由图2可以看出，在果实发育前期，L40留果量处理的VvLOX 、VvADH 表达量高于其余两个处理。在2017年的花后10周，L40显著高于其他处理。果实发育后期，L60两者基因表达量显著上调，VvLOX表达量于花后14周显著高于其他两个处理，VvADH 表达量则一直上调，于花后16周与其他两处理形成显著性差异。

 

  图2中列举了2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径过程中的香气合成相关基因表达变化规律。在果实发育过程中，各处理VvDXS表达稳步上调， 2017年和2018年的各处理的基因表达变化趋势相近。其中L40的表达上调趋势最快，于花后14周显著高于其他两个处理。L40和L60果实其VvGPPS 在2017年和2018年的表达变化规律相似，L60先于L40达表达峰值，随后下降。在2017年，L80果实其VvPNLinNer1 于花后10周达表达高峰，L40和L60于花后12周达表达峰值，并且L60最高表达量高于L40。但在花后16周，L40处理其表达量上调，并且显著高于其余处理。在2018年同样出现类似的表达变化趋势，在果实发育前期，L80其表达量高于其他两个处理，在果实发育中期或是后期，L40的表达量更高。

 

  3　讨论

 

  疏花疏果处理是葡萄生产管理过程中不可缺少的一个环节，主要通过减少树体负载量影响树体及果实的生长发育。适宜负载量可以调节植株营养生长和生殖生长的均衡发展，维持丰产稳产，同时避免过分耗损树体营养，从而减少大小年现象发生。研究表明，不同负载量会显著影响果实糖酸等营养品质，适当进行疏穗处理能有效提高果实品质，增长商品经济价值。Gil等通过对葡萄进行疏穗和疏果处理发现，两种处理较对照组均明显提高单果重，降低可滴定酸含量，并且疏穗处理显著提高可溶性固形物含量，但疏果处理作用不明显。

 

  本试验研究表明，L40较L60、L80其单果重显著提高，可滴定酸含量显著降低，可溶性固形物含量差异不明显，与上述结果相一致。疏果处理对果实外观品质影响明显，L80处理较其余处理其果粒偏小、果面色泽不均匀，成熟度不一致。这与前人实验结果相一致，过高留果量会导致果粒偏小、色泽差、优质果少，从而影响经济效益及加工产业的发展。另有研究表明，光照条件会显著影响果实的内外在品质，影响果实着色。光照可能是导致L80果实品质不好的另一个原因，相比L40果穗，因其空间受限，果粒分布过于紧凑，导致受光面积不均匀，从而果实发育不一致。

 

  同样地，负载量的高低对果实的风味品质也有着极大的影响,负载量的改变直接影响到树体的库源平衡从而影响果实风味物质积累。本试验研究结果表明，L60的葡萄果实C6化合物总量在整个发育过程高于L40处理，这与Naor等的实验结果一致，随着负载量的增加，葡萄果实的草香味增加。果实的草香味呈现主要是由于C6化合物的存在，过高浓度的草香味降低果实风味品质。但同时笔者也观察到，L80葡萄果实C6化合物含量在果实发育前期高于L40，发育后期低于L40，推断可能是由于L80果穗在发育后期所需营养需求过大，库源矛盾突出导致营养物质积累减少，从而使得果实中风味物质合成减少。VvLOX 基因是C6化合物合成途径中上游途径基因；VvADH 为下游途径基因，这两个基因通过作用于醇脱氢酶催化醛类转为醇类。L60果实在发育后期其VvLOX 基因表达量明显升高且高于其他两处理，这与醛类物质合成变化规律相似。VvADH在果实发育后期依然保持较高的表达水平，这与成熟期果实中高含量醇类物质有关，且相关性分析表明VvADH 转录变化规律与两种醇类物质合成成极显著相关关系（表4）。

 

 

 

  萜烯类物质是玫瑰香型葡萄中含量非常丰富的一类化合物，其中含量最高的为单萜类物质。果实中的单萜化合物含量受疏穗处理影响较大，有研究表明，增加枝条负载量会降低果实中芳樟醇及芳樟醇氧化物含量。Rutan等得出类似结论，疏穗处理会使果实中C13降异戊二烯衍生物和单萜含量增加。但同样也有研究表明，疏穗处理并不会显著影响果实中单萜含量，这或许是因为品种不同或是当地气候条件的影响。本试验中，葡萄果实萜烯类物质总含量于成熟期随着留果量的增加而降低。在果实不同发育阶段，各处理间的萜烯类物质总含量变化趋势与VvDXS 转录变化规律相一致且显著相关（表4）。

 

  随着果实发育成熟，萜烯类物质总量逐渐增加，VvDXS 转录上调，这与Zhang等的实验结果相类似，VvDXS2 转录水平与果实中萜烯类物质总量相关。另Pearson相关系数分析表明，VvDXS 转录变化与不同处理下果实中各香气组分积累差异呈相关关系，这表明留果量处理会显著影响VvDXS 的转录表达，进而影响果实中各萜烯类物质组分含量。芳樟醇是对玫瑰香型葡萄香味贡献最大的一种单萜物质，其在果实中的含量被认为与VvPNLinNer1转录水平相关。在本试验中，各处理间的芳樟醇含量变化趋势与VvPNLinNer1 的转录变化规律相类似，在果实发育前期，L80处理其芳樟醇含量及VvPNLinNer1 转录水平高于其他两个处理，于成熟期L40处理高于其他处理。但不同处理间的VvPNLinNer1 转录变化与芳樟醇含量未表现出相关关系，这表明留果量处理未对VvPNLinNer1 的转录表达起调控作用。

 

  对于其他萜烯类物质如萜品醇、橙花醇、去氢芳樟醇、香茅醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮，这些物质在L60和L80果实中其含量都先于L40到达高峰，然后下降。与VvGPPS 的转录变化规律相类似，L60处理果实其表达高峰先于L40，这与前人报道VvGPPS 转录水平与果实中萜烯物质含量有关相符。在2017和2018年，各处理间果实中萜烯类物质组成成分有差异，萜品醇、顺式氧化芳樟醇和去氢芳樟醇在2017年果实中检测到，香茅醇则只在2018年果实中发现，推测可能是由于大部分物质是以结合态形式储存在果实中，游离态形式含量太低以致未被检测到。

 

  本试验结果表明，L40、L60、L80三个不同留果量处理间，L40果实品质表现最佳，其穗形美观、果粒丰满、酸度最低。此外，三个处理间的香气物质成分及含量在果实整个发育阶段表现出一定的规律性，如在成熟期，L60果实中呈草香味的C6化合物含量显著高于其余处理；L40果实中芳樟醇含量最高，萜烯类物质总含量最高。在果实发育后期，L60、L80果实中其各种萜烯类香气物质含量下降更快，且某些萜烯类物质如顺式氧化芳樟醇、香茅醇消失时间也更早，因此

L40果实其香味保留时间更长。在基因转录方面，VvDXS 转录表达受留果量处理影响明显，与果实中萜烯总量呈显著相关关系。综上所述，L40处理的果实其品质最佳，显著提高果实商品价值性，且其香味保留持久，可延长挂果期。