病毒病防控岗位

胡国君 董雅凤 张尊平 范旭东 任芳 李正男

　　葡萄（Vitis spp.）作为一种重要的经济树种，在世界范围内广泛种植，但由于长期的无性繁殖，容易感染多种病毒病害。目前世界上报道的葡萄病毒有60多种，其中，分布最广、危害最重的葡萄病毒病害主要有扇叶病、卷叶病、皱木复合病和斑点病。皱木复合病可通过嫁接传染，其病原尚不十分明确，已有研究表明，葡萄病毒A（GVA）、葡萄病毒B（GVB）和沙地葡萄茎痘病毒（GRSPaV）与该病害的发生有关。据报道，葡萄感染皱木复合病后产量可减少14%-70%，嫁接成活率降低40%，生长量减少30%。目前控制病毒病的主要途径就是采用无病毒的繁殖材料，前期研究结果显示，GRSPaV的脱除率较低，为了提高脱毒效率，本研究以感染GRSPaV的葡萄试管苗为研究材料，比较化学处理不同试剂浓度和处理时间的脱毒效果。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　实验室保存的携带GRSPaV的“巨峰”葡萄试管苗。

　　1.2　加病毒醚的MS培养基配制

　　先配制浓度为1,000μg/mL病毒醚溶液，然后将母液加入高温灭菌后冷却至60-70℃的MS培养基中，使其终浓度为15和25μg/mL，加完后迅速混匀，置于室温条件备用。

　　1.3　离体植株继代培养

　　葡萄试管苗一般培养40-50d后进行继代，每次继代切取1.5-2cm左右的茎尖或茎段转到新鲜的MS基本扩繁培养基中，每次继代的离体材料需抽样进行RT-PCR检测，以便确保带毒。当离体材料扩繁到所需数量后，选取长势一致的植株，切取1 cm茎尖进行脱毒处理。

　　1.4　脱毒处理

　　将切取的1cm茎尖移入含病毒醚（终浓度为15和25μg/mL）的MS培养基中，每瓶3株，设3次重复，室温24±1℃下进行培养，每天光照培养16h，黑暗培养8h，光照强度为40μmol s-1 m-2。每5d记录一次植株的生长状况，共处理85d，统计新生的侧枝（≥ 5mm）数，并测量植株的株高。对照组将切取的茎尖直接移入基本的MS培养基中，每瓶5-6株，设3次重复，同条件下进行培养。当材料处理到45、65和85d时切取1.0mm的茎尖（主芽和侧芽），移入新鲜的基本MS扩繁培养基中，记录再生植株的成活率，当再生植株继代4次后采用RT-PCR的方法对再生植株的带毒情况进行检测。

　　1.5　总RNA提取

　　称取0.1 g样品，液氮研磨，加入0.5 ml提取缓冲液中，充分震荡混匀；向匀浆液中加入25μL20%SDS混匀，65℃ 2 0 min； 加入125μL 5 M KOAc，震荡混匀后冰上放置20min，4℃，12,000g离心15min；吸上述上清400μL加入2倍体积的无水乙醇，冰上放置10min后，4℃，1,2000g离心10min；沉淀用75%乙醇洗涤两次，加入50μLDEPC处理去离子水。

　　1.6　RT-PCR检测

　　取上述总RNA 2 μL、6碱基随机引物1μL、DEPC处理去离子水7μL于一离心管中，沸水变性6 min，冰上3min。依次加入：5×RT buffer 2μL、dNTPs（10mmol/l）1μL、M-MLV（200U/μl）0 . 5 μ L 、R n a s i n （40U/μ L ）0.5μL，用水补足至20μL。混匀后37℃水浴1h，70℃灭活5min，冰浴3min，-20℃备用。

　　取上述cDNA 2μL，依次加入10× RCR buffer 2.5μL、dNTPs（10 mmol/L）2 μL、同源和互补引物（表1）各0.5 μL、 rTaq DNA聚合酶 1 U，最后定容至25μL。

扩增条件为：95℃预变性3min，94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环，72℃ 7 min。扩增结束后取6μL PCR产物和1μL 6×Loading buffer 在1.2%的琼脂糖凝胶中进行分离，经0.5 mg/L EB溶液染色后在BIO-RAD凝胶成像系统中，观察扩增结果。

　　2　结果与分析

　　2.1　病毒醚对葡萄试管苗的影响

　　处理85d后，含15和25 μg/mL病毒醚（R15和R25）培养基中的试管苗均未发生死亡的现象。在处理的最初5-25d，R15和R25与对照组植株的长势及株高等未表现出明显的差（表2）。25d后，尽管在数据分析中，处理组与对照组植株无明显差别，但处理组植株开始表现出药害，具体表现为：叶片上出现轻度的褪绿或坏死斑，且植株矮化等。处理65d后，处理组植株的药害比较明显，对照组的株高明显高于处理组，但增殖方面二者仍无明显的差异。当处理到85d时，对照组和处理组均出现叶片变黄或变褐色的现象，推测为自然衰老的生理反应。此外，病毒醚的药害还表现在对根的抑制上（图1），研究表明，对照组、R15和R25的生根率分别为100%、81.8%和95.0%，且处理组的根明显比对照组短。

　　2.2　病毒醚的脱毒效果分析

　　为了提高检测的准确度，所有再生植株均进行了两轮的病毒检测， 第1 轮的检出率为25.2%(38/151)，第2轮的检出率是第1轮的2倍，为47.7% (72/151)。结果表明，病毒的脱除率与病毒醚浓度有关。处理45、65和85d的再生植株中，R25的脱毒率均高于R15的脱毒率。R25和R15在这三个时期的平均脱毒率分别为81.7% (60/74)和68.8% (53/77)。通过比较发现，病毒的脱除率还与处理时间有关，随着处理时间的延长而增加。25μg/ml病毒醚处理45、65和85d后的再生植株的脱毒率分别为21.4、37.5和77.8%（表3）。

　　3　小结

　　葡萄对病毒醚比较敏感，整个处理期，植株的长势均与对照组相比较弱。长期的脱毒实践让我们发现，GRSPaV是比较难于脱除的一种葡萄病毒，常用的热处理脱毒脱毒率不足50%，使用病毒醚后，能获得较高的脱除效率，因此，该方法具有很好的应用前景。