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加工与贮运研究室
刘延琳
氨基甲酸乙酯（ E t h y lCarbamate, EC, 又叫Urethane），早在1943年就被证实是一种致癌物质，对啮齿类动物是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，并且乙醇对EC的致癌性有促进作用。1971年，Lofroth和Gejvall在葡萄酒中发现了EC，1976年，Ough在酸乳酪和葡萄酒中检测到了EC，此后，在20世纪70～80年代，世界各国研究学者先后又在蒸馏酒、白兰地、威士忌、酱油和面包等发酵饮料和食品中检测到了EC。
1 EC的形成途径（主要介绍白兰地和葡萄酒）
1.1 由氰化物和乙醇反应而生成
有研究结果表明，蒸馏酒如白兰地中EC的形成首先是氢化物被氧化成氰酸，然后氰酸和乙醇反应而产生。发酵过程中存在于植物中的氰化物（或氰）参与了EC的形成反应。反应过程中乙醇、连二碳基化合物和光线起了作用，氧气也是EC形成过程中必需的，EC在贮存过程中逐渐形成，特别在见光后也会形成。
1.2 尿素和乙醇反应形成
由尿素和乙醇生成EC的反应式如下：H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C3H5+NH3氨甲酰化合物主要有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿膜素等。其中，尿素一直作为酵母的氮源而添加到发酵液中，尤其酿造高质量的白兰地原酒时，为了降低影响风味质量的杂醇油的生成，添加一定量的尿素或硫酸氨等无机氮源。而在葡萄酒酿造中影响尿素含量的因素很多。
有研究者对精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒汁发酵过程中对EC形成的影响进行了研究，结果表明，EC的主要来源是由精氨酸分解而产生的尿素，由尿素形成的EC量占成品葡萄酒中EC含量的绝大部分，因而形成EC的主要前体物质是尿素。研究表明，在葡萄汁发酵过程以及贮藏过程中，都存在形成EC的前体物质。在葡萄酒的贮藏过程中，仍存在乙醇和尿素形成EC的反应，但此阶段形成EC的速度较慢。酵母菌在生长繁殖和进行酒精发酵时，合成的大量尿素除了满足自身菌体需要外，多余的尿素被分泌到体外，从而使酒中的尿素含量增加，酵母菌细胞内的精氨酸酶的活力也会随之提高，进一步加速了尿素的生成。酒中尿素主要由精氨酸经酵母菌细胞内精氨酸酶-尿酶（AU）途径分解而来；乳酸菌(LAB)胞内精氨酸降解及瓜氨酸的形成也会影响EC的形成。
2 影响葡萄酒中EC含量的因素
2.1 葡萄汁中精氨酸的含量
葡萄酒中E C 的形成主要与葡萄汁中精氨酸浓度有关。Gu和Soufleros等研究了葡萄品种中砧木、修剪、灌溉及土壤施肥等对葡萄汁精氨酸浓度及葡萄酒中EC浓度及潜在浓度的影响，结果表明，葡萄栽培管理措施对葡萄汁中精氨酸浓度有很大影响，尤其重要的是，葡萄汁精氨酸浓度与葡萄酒中EC的含量存在很大的相关性。因此，要降低葡萄酒中EC含量，降低葡萄汁中精氨酸含量极其重要。
葡萄园的氮肥对葡萄浆果和葡萄汁中氮的含量产生直接的影响。Spayd等的研究表明，随着氮肥施用量的增加，葡萄汁中精氨酸的含量与施加氮肥的量成正比。将收获的葡萄酿成酒，葡萄酒中尿素的含量与施加氮肥的量也成正比。但对酵母营养来说，葡萄汁中氮量不足，不应通过葡萄园施加氮肥途径弥补。一般情况下，如果精氨酸含量超过1000mg/L，就可以认为葡萄园施肥过量。
葡萄酒中用豆科植物作为地面覆盖作物时，可明显增加葡萄果实中氮的含量。豆科植物作为葡萄园的地面覆盖作物时，会使葡萄藤中氮的含量增高，葡萄藤中氮含量与葡萄汁中精氨酸含量有很大相关性。因此，如果葡萄园用豆科植物做覆盖物，就应该对土壤和葡萄藤中氮的含量进行特别检测，以避免葡萄汁中精氨酸含量过高。
Huang和Gu等研究发现，葡萄园位置、葡萄品种及砧木对葡萄汁中氨基酸含量有影响。另外，葡萄汁的含氮量与葡萄园的位置、土壤、灌溉、葡萄收获时的天气以及葡萄成熟度等也有关。
2.2 葡萄汁营养添加剂
在酒精发酵过程中，因酵母生长繁殖的需要，葡萄汁中应含有一定量的含氮化合物，否则，就会造成酵母发酵中途终止。研究表明，发酵时加入磷酸氢二氨能明显加快发酵速率，防止发酵“阻滞”现象。为避免发酵的延迟和阻滞，美国酒精、烟草和焰火局允许向氮不足的葡萄汁中加入960mg/L的磷酸氢二氨（即每升200mg氮）。然而，Virginia等研究表明，磷酸氢二铵的添加量及添加时间也会影响葡萄酒中EC生成量。因此，酵母酒精发酵时加入磷酸氢二铵能否导致EC的增加，磷酸氢二氨能否用作酵母的营养添加剂，也是有待于研究的课题。
2.3 带酒脚陈酿
在白葡萄酒酿造工艺中，为了使葡萄酒风味特征更突出，一般在发酵结束后带酒脚陈酿。在贮藏的第一周内，含氮化合物（氨基酸和蛋白质）就从酵母细胞中快速分泌出来；随后，由于酵母的自溶，在贮藏期间含氮化合物会逐渐从细胞中释放出来。但也有研究表明，如果葡萄汁中含氮量低，即使延长酵母泥的接触时间也不会增加EC的潜在性，反之亦然。而Mauricio等的研究表明，如果陈酿期间处于通风状态，尿素大部分被降解，就不会形成尿素的积累。
2.4 运输和贮存中温度的影响
加拿大安省酒类管制局发现，过高的贮存温度会使葡萄酒中的EC含量增加。很多研究表明，温度是影响酒中前体物质（尿素和瓜氨酸等）和乙醇反应速度的重要因素。因此，建议佐餐葡萄酒中尿素含量最好不要超过2mg/L，否则，酒中EC的潜在浓度就有可能超过美国的非强制性限量标准15μg/L。因此，尿素含量高的酒不能在高温下贮存和运输。
2.5 降低葡萄酒中EC含量的措施
根据EC形成途径及影响EC形成因素的分析，降低葡萄酒中EC含量的措施有以下几方面。
2.5.1 葡萄园管理
葡萄园中尽量避免过量施加氮肥，并且对葡萄园土壤及葡萄枝蔓含氮量进行检测，以适时调整对葡萄园的施肥管理。如果葡萄园土壤含氮量较高时，冬天不要用豆科植物作为覆盖物。建园时，应选择已知葡萄枝蔓中氮含量低的砧木进行嫁接。葡萄园管理是降低葡萄汁中精氨酸含量的最关键措施。
2.5.2 酵母菌株的选育
酵母分泌的尿素是葡萄酒中EC的主要前体物质之一，葡萄酒酵母代谢精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特异性，不同酵母菌对降解精氨酸产生尿素有显著差异。
构建酵母工程菌也是降低尿素分泌的措施之一，但是由于所构建基因在葡萄酒环境中还不能充分表达，因此选育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株，特别是选育精氨酸酶活力低或用分子育种手段选育精氨酸酶缺陷型酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。
2.5.3 苹果酸-乳酸菌（MLB）的选育
苹果酸-乳酸菌的精氨酸代谢及瓜氨酸分泌也具有菌株特异性，在进行葡萄酒MLB降酸时，应选择没有精氨酸代谢或代谢中没有瓜氨酸分泌的菌株，以尽量降低葡萄酒中EC的含量。另外构建ADI-的MLB用于苹果酸-乳酸发酵，是降低葡萄酒中的又一有效措施。
2.5.4 酿造工艺
葡萄酒酿造过程中，EC的形成与酿造工艺也有很大关系。研究表明，酵母在高温下发酵、厌氧条件下贮存，尿素分泌量增加。而同时接种酵母和苹果酸-乳酸菌的葡萄酒酿造工艺，发现发酵结束后酒中尿素含量很低。因此，葡萄酒酿造时了解酵母发酵分泌尿素的特性，选择合理的酿造工艺，不要在葡萄汁中添加过量的含氮营养剂，葡萄酒的陈酿和贮藏运输尽量在低温下进行等，也时控制EC生成的措施之一。
2.5.5 使用酸性脲酶
酸性脲酶能在不同葡萄酒环境中，不同程度降低酒中尿素的含量。为了降低葡萄酒中EC的含量，国际葡萄与葡萄酒组织允许使用发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）发酵生产的酸性脲酶降低葡萄酒中尿素的含量。
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