鲜食葡萄栽培岗位

冯娇 陶建敏

 

　　摘　要：【目的】探究GA3与CPPU对‘阳光玫瑰’葡萄‘果锈’相关物质合成的影响，为研究‘阳光玫瑰’葡萄的防锈措施提供理论依据。【方法】以‘阳光玫瑰’葡萄为实验材料，于花后两周（果穗约长6cm），用25mg·L-1的GA3分别和0mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1、15mg·L-1的CPPU组合处理果穗，以清水处理作为对照（CK）。待果实进入转色期（大约花后8周）后分别采集不同成熟阶段的葡萄果实，测定葡萄果皮‘果锈’发生率、果皮中次生代谢物含量等指标。【结果】与对照相比，GA3和CPPU处理显著降低了果皮中白藜芦醇、总酚和木质素含量，咖啡酸、香豆酸、丁香酸等酚酸含量随CPPU浓度增加显著下降，儿茶素和没食子酸含量随CPPU处理浓度增大先升后降。CPPU处理的葡萄果皮‘果锈’发生率明显降低。【结论】 生产实践上可用GA3和CPPU处理葡萄果穗作为一种栽培措施，降低‘阳光玫瑰’葡萄‘果锈’的发生水平，提高葡萄的商品性，适宜浓度为25 mg·L-1GA3＋5 mg·L-1CPPU。

　　关键词：‘阳光玫瑰’；‘果锈’；GA3与CPPU；酚类物质；木质素

　　‘阳光玫瑰’（Viti s labr u sc anaB a i l e y×V. v i n i f e r a .L . ‘ShineMuscat’）是二倍体鲜食葡萄品种（Yamada et al.， 2008），引自于日本，因其果粒较大，且品质优良，受到大量葡萄生产者和消费者的欢迎。但我国大多数地区栽培的‘阳光玫瑰’成熟时浆果表面却出现微小的红褐色斑点，影响果面光洁度，降低了葡萄的市场价值，经济效益显著下降。研究者们将这一现象定义为‘果锈’，主要表现为果实表面浮生锈色木栓化物质（Knoche et al.， 2011；Wei Henget al.，2013；聂继云等，2001）。

　　随着果实生长，果实表皮细胞角质层破裂，木栓化程度加深，引起表皮细胞、甚至皮层细胞死亡产生一层厚厚的锈斑。这种锈斑往往发生在果皮表面（Inoue et al.，2006；孔德康等，2011）。

　　‘果锈’是果实成熟期的一种生理紊乱现象。花期多雨、低温、高湿、植株营养失调、病虫害、用药不当、机械损伤、果园通风不良等都是诱发‘果锈’生成的外界环境因素（吴江等，2006；孙智广等，2008）。Yuka Suehiro（2014）等推测白藜芦醇等酚类化合物与‘果锈’生成相关；研究表明，香豆酸和咖啡酸等酚酸类物质为木质素合成提供前体物质。从‘果锈’的形成途径来看，‘果锈’的重要组分木栓层的形成与木质素合成有关（Jean-JacquesMacheix et al.，1991；张智涛，2011），木质素的合成，促进木栓形成层出现，从而在一定程度上促进锈斑的形成（张勃，2004）。

　　在葡萄的生产栽培中，赤霉素（GA3）和氯吡脲（CPPU）作为植物生长调节剂已有广泛应用（J. Retamales et al.，1995；辛守鹏等，2015）。GA3能打破休眠，促进茎叶的生长，促进植物细胞分裂，使果肉细胞纵向伸长、增大，起到增大果粒的作用（霍树春等，2007）。GA3参与果树生长发育的各个环节，已成为重要的促生长激素，广泛应用于农林园艺业（吴俊等，2001）。CPPU，N-（2-氯-4-吡啶基）-N＇-苯基脲，属于苯基脲类细胞分裂素，是一种新型植物生长调节剂。CPPU的生理活性极高，大量田间实验证明，它能刺激果树生长，显著促进浆果类果实发育，改善果实品质，可广泛应用于各种果树上，是目前最有前途的生长调节剂之一（刘耀光等，2007）。GA3和CPPU的组合使用能显著改善葡萄果实的外观品质，诱导果实无核化（余智莹等，2010），同时对葡萄的香气组分也有一定的影响（王继源等，2016）。

　　目前已有研究表明， 外源GA3可防止苹果‘ 果锈’ 形成（Buban，2001；Barandoozi etal.， 2009），适当浓度的外源绿原酸处理可显著降低‘金冠’苹果‘果锈’指数（李健花，2014），套袋也可以在一定程度上控制苹果、梨、葡萄果实表面‘果锈’的生成，降低‘果锈’发生程度，提高果面光洁度（孙智广等，2008；柯凡君等，2011）。然而，就外源植物生长调节剂处理对‘阳光玫瑰’‘果锈’的影响鲜有报道，因此本文以‘阳光玫瑰’为试验材料，用GA3和不同浓度的CPPU组合处理葡萄花穗，通过体视显微镜观察同一成熟时期不同处理的葡萄果皮特征，从‘果锈’生成相关酚类物质和木质素含量等方面阐述GA3和CPPU对‘果锈’生成的影响，探究该品种的防锈技术，旨在为新型品种‘阳光玫瑰’的标准化生产栽培提供理论依据和技术指导。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　试验于2016年5-10月在南京农业大学汤山葡萄实验基地进行。供试品种为7年生‘阳光玫瑰’葡萄，采用平棚架避雨栽培，株行距为3.0 m×6.0 m，“H”型树形，土肥水管理及病虫害防治同常规。

　　1.2　方法

　　1.2.1　田间处理与样品采集

　　选取树势基本一致的‘阳光玫瑰’葡萄，处理前将花穗修剪至距离穗尖约4cm的位置。于花后2周分别用25mg·L-1GA3（Ⅰ），25mg·L-1GA3+5 mg·L- 1CPPU（ Ⅱ ） ，25mg · L - 1GA3+10mg · L - 1CPPU（Ⅲ），25mg·L-1GA3+15mg·L-1CPPU（Ⅳ）浸蘸花穗5-10s。处理前集中疏果，每穗大小及遮阴情况保持一致。“H”型树形的每一个主蔓作为一个处理，4个处理随机分布于6棵树，每个处理三个主蔓，余下主蔓用清水处理作为对照（CK）。

　　盛花后80天（7 月31日）开始，每隔10 d取一次样品，从每个处理果穗的上、中、下部随机采取50粒大小均匀、成熟度一致的果实，用冰袋带回实验室，剥离果皮，液氮速冻，-70℃冷冻保存，待果实完全成熟时（9月18日），采集五个处理的葡萄果实，通过体视显微镜观察‘果锈’发生情况，取果皮置于-70℃冰箱中保存，用于测定白藜芦醇、香豆酸、丁香酸等酚类物质及木质素含量等。

　　1.2.2　试剂与标品

　　赤霉酸（上海同瑞生物科技有限公司），CPPU（四川省兰月科技有限公司），Na2CO3，冰乙酸，溴乙酰，高氯酸，Folin-Ciocalteu试剂，甲醇分析纯，乙酸乙酯，盐酸，抗坏血酸，甲醇（色谱纯），乙醇，没食子酸，香豆酸，咖啡酸，阿魏酸，儿茶素，丁香酸和白藜芦醇标品均购自上海源叶生物公司（纯度≥98%）。

　　1.2.3　仪器与设备

　　体视显微镜（ L E I C AS8AP0），酶标仪（德国TECAN公司），SB-5200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），超高效液相色谱仪（美国Waters公司）等。

　　1.2.4　‘果锈’指数统计

　　参照张勃（2004）等方法，从7月31日起，对CK和各处理果实分别进行分级和锈斑率统计。根据‘果锈’程度将果实分级：无锈果为0级，‘果锈’面积<5%为1级，6%~15%为2级，16%~25%为3级，>25%为4级。‘果锈’指数=（0级×a＋1×b＋2级×c＋3级×d＋4级×e）×100/（4级×n）。注：a、b、c、d、e分别为0~4级果的统计数，n为样本总数。

　　1.2.5　体视显微镜观察

　　利用体视显微镜（放大25倍）观察同一成熟时期（9月18日）CK和四种不同处理‘阳光玫瑰’葡萄的果皮特征，并拍照记录果皮‘果锈’的发生情况。

　　1.2.6　单体酚类物质含量测定

　　采用反相高效液相色谱法测定葡萄果皮中单体酚类物质的含量（成宇峰等，2008）。分别取3g同一成熟时期（ 9月18日）CK和不同处理的葡萄果皮，研磨后溶于25ml 100%甲醇中，再加入80mg抗坏血酸（溶于15ml纯水中），再加入10ml 6mol盐酸，将所有溶液置于100ml锥形瓶中，超声波降解处理2min，充氮气排出锥形瓶内的空气，密封后置于35℃提取16h后，12000r·min-1，4℃离心20min，吸取上清液，40℃旋转蒸发除去甲醇，用30ml乙酸乙酯溶解后先萃取一次，之后再用20ml乙酸乙酯再萃取两次，合并所有萃取液，在40℃条件下旋转蒸发至干再溶于5ml 50%甲醇（色谱纯）中，置于-70℃条件下避光保存。将经过处理的果皮样品在确定的色谱条件下进样，根据标准曲线定量。

　　1.2.7　白藜芦醇含量测定

　　采用高效液相色谱法测定葡萄果皮中的白藜芦醇含量。分别称取1g同一成熟时期（9月18日）的CK和不同处理的果皮样品，研磨后迅速与25ml 80%的乙醇混匀，在60℃水浴锅中水浴30min，4℃ 8000 r·min-1离心15min，吸取上清液。在液氮中速冻至固态后，放入冷冻干燥器中冻干至粉末状态（避光），溶解在2ml 50%的乙醇中，转移至2ml离心管中，离心后吸取上清液，储存于-70℃备用。上样前用1.0ml注射器吸取处理好的样品通过0.2μm的有机系滤膜过滤，使用标准曲线法定量。

　　1.2.8　总酚含量测定

　　参考Eduardo Pastrana-Bonilla（2003）等的方法，总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu试剂法。分别取同一成熟时期（9月18日）CK和不同处理的果皮经液氮研磨后，准确称取2g于50ml锥形瓶中，加入10ml甲醇（分析纯，含2%HCl），在室温、黑暗条件下提取24h，4℃12000r·min-1离心10min，吸出上清液。吸取200μl上清液于5.0ml的离心管中，加入1.0ml的Folin-Ciocalteu试剂，0.8ml 7.5%的Na2CO3溶液，缓慢搅拌反应30min后，用酶标仪在765nm处比色测定吸光度OD值。总酚含量表示为mggallic acid ·g-1. F.W。没食子酸作标准品制作标准曲线。

　　1.2.9　木质素含量测定

　　样品制备：将同一成熟时期（9月18日）CK和不同处理的葡萄果皮用剪刀剪碎，然后将样品绝对烘干，研成粉末，用电子天平准确称取果皮0.02g各三份。将制备好的样品粉末放入5ml试管中，加入25%的溴乙酰-乙酸溶液（w/w）2ml和高氯酸0.08ml，将管口密封，于70℃恒温水浴30min，每隔10min振荡试管。取四分之一的反应液，移入已装有1ml 2mol·L-1NaOH和2.5ml冰乙酸混合液的容量瓶内，振荡充分混匀并用冰乙酸定容至10ml。以冰乙酸为空白溶液，用酶标仪对样品溶液在波长260nm处进行扫描测定吸光度。参照Hatfield R D（1999）的方法，Lignin=Abs×liters×100%/Wsample，Lignin为木质素含量，Abs为样品溶液木质素吸光度，Liters为样品溶液定容体积（ml），Wsample为样品绝干重量（g）。

　　1.3　统计分析

　　所有测定重复3 次， 数据经Excel 2007和SPSS16.0进行统计分析。

　　2　结果与分析

　　2.1　‘阳光玫瑰’不同处理之间‘果锈’指数的比较

　　从7月31日开始，统计不同处理果面的‘果锈’情况，并计算‘果锈’指数。7月31日至8月14日CK和不同处理果面都没有‘果锈’发生。从8月21日起，极少数CK果面开始出现少量锈斑，随着CK葡萄果实成熟，出现‘果锈’的葡萄变多，锈斑面积增大，‘果锈’指数急剧增长，直至9月中旬CK的‘果锈’指数趋于稳定。Ⅰ处理的‘阳光玫瑰’自8月25日起果面出现少量锈斑，伴随成熟，‘果锈’指数呈上升趋势。Ⅱ处理的‘阳光玫瑰’自8月31日起少量果实果面出现极少锈斑，不同于CK和Ⅰ处理，Ⅱ处理的葡萄果实锈斑面积小，出现‘果锈’的葡萄少，‘果锈’指数上升趋势相对小。Ⅲ和Ⅳ处理的‘阳光玫瑰’直至9月中旬开始成熟时才极少量出现，‘果锈’指数很低，几乎可以忽略不计（图1）。

 

　　2.2　同一成熟时期不同处理葡萄果皮特征差异

 

 

　　图2显示，同一成熟时期不同处理的‘阳光玫瑰’果皮表面存在显著差异。CK、Ⅰ和Ⅱ处理的葡萄果皮均有‘果锈’出现，且‘果锈’依次减少，Ⅲ和Ⅳ处理的葡萄果皮几乎看不到‘果锈’。从果皮颜色来看，CK、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ处理的葡萄果皮颜色从黄色逐渐到黄绿色，这与不同处理同一时期的成熟度不同相关联。

　　2.3　同一成熟时期不同处理葡萄木质素含量的差异

 

　　由图3可知，同一成熟时期，经过处理后的葡萄果皮木质素含量显著降低，CK、Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ差异显著，Ⅲ和Ⅳ无显著性差异。

　　2.4　同一成熟时期不同处理葡萄总酚含量的差异

 

 

　　由图4可知，同一成熟时期，经过处理后的葡萄果皮总酚含量显著下降，CK与Ⅰ处理无显著性差异，与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ处理差异显著。

　　2.5　同一成熟时期不同处理葡萄果皮单体酚类物质含量差异

 

　　反相超高效液相色谱结果显示（表1），果皮中6种酚类物质含量差异相对较显著。香豆酸、丁香酸和阿魏酸整体含量较高，变化幅度相对较大；没食子酸、儿茶素含量偏低，咖啡酸含量最低。随着CPPU处理浓度增大，香豆酸、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸含量呈下降趋势。CK儿茶素含量最低，Ⅰ和Ⅱ处理的果皮儿茶素含量上升，Ⅲ和Ⅳ处理后儿茶素含量相对降低，但仍高于CK。CK和Ⅰ处理没食子酸含量无显著性差异，与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ处理含量差异显著，呈先增大后降低的趋势。

　　2.6　同一成熟时期不同处理葡萄果皮白藜芦醇含量差异

 

　　超高效液相色谱结果显示（表2），同一成熟时期，与CK相比，不同处理葡萄果皮中白藜芦醇含量依次降低，且差异显著。Ⅲ和Ⅳ处理之间差异不显著。

　　3　讨论

　　从‘果锈’的发生结果来看，葡萄果实达到一定成熟度时才会出现锈斑， 未处理的‘ 阳光玫瑰’‘果锈’更明显，可能与其成熟度更高有关。这与前人在CPPU推迟脱落酸合成高峰且使其峰值变小上的研究结果相一致（王央杰等，2007）。推测CPPU推迟了果实的成熟期，促进IAA 合成，IAA可能抑制‘果锈’生成（Mochidaet al.，2013；张勃，2004），因而‘果锈’减少，具体机理尚待研究。

在苹果和梨上的研究表明，苯丙烷代谢等次级产物代谢途径参与了‘果锈’形成过程（Wei Henget al.，2013）。苯丙烷类代谢途径是植物次生物质代谢中的重要途径，与酚酸、类黄酮、白藜芦醇等酚类物质和木质素等许多次生代谢物的合成有关（Jean-JacquesMacheix et al.，1991）。苯丙烷代谢途径中，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL酶）的催化下转化为肉桂酸，肉桂酸羟化酶（C4H酶）催化肉桂酸转化为香豆酸，香豆酸在4-香豆酸-CoA连接酶（4CL酶）的催化下活化为4-香豆酰-CoA，结合乙酰-CoA在白藜芦醇合成酶（RS酶）的催化下合成白藜芦醇；香豆酸在酶的催化作用下，经咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等中间产物，生成香豆醇、松柏醇和芥子醇，依次聚合形成三种木质素单体，最终聚合成苯丙烷合成途径的终产物—木质素（Dixon, 2001；Wang et al.,2011；秦晨亮等, 2015；Wu et al.,2017）。木质素是木栓层形成，果实木质化的标志（吴锦程等，2006）。‘果锈’是一层木栓化次生保护组织（Ogoro et al.，2007；滕元文，2005），酚类物质、木质素的含量变化与‘果锈’生成密切相关。

　　PAL酶是苯丙烷代谢途径的起始限速酶，转录水平直接影响酚类物质和木质素的合成水平。RS酶是二苯乙烯合酶（STS酶）中的一类，白藜芦醇等芪类化合物合成途径中特有的酶。

　　本研究中，GA3搭配不同浓度的CPPU处理‘阳光玫瑰’葡萄果穗，伴随处理浓度增大成熟期依次推迟，成熟时同一时期CK成熟度最高；白藜芦醇含量和总酚含量依次降低，这与孙建平（2003）的研究结果一致，高成熟阶段的葡萄果实酚类物质生物活性高于低成熟阶段的葡萄果实。香豆酸、丁香酸和阿魏酸3种酚酸类物质变化幅度较大，随着CPPU浓度增大而下降，与总酚含量变化趋势存在伴随性。

　　咖啡酸、没食子酸和儿茶素含量变化幅度相对较小，CPPU处理浓度增大，咖啡酸含量降低；CK儿茶素含量最低，Ⅰ和Ⅱ处理的果皮儿茶素含量上升，Ⅲ和Ⅳ处理后儿茶素含量相对降低，但仍高于CK；与儿茶素类似，随处理浓度增大，没食子酸含量呈先升高后降低的趋势。这可能是由于CK果皮中一部分儿茶素和没食子酸最终转化为木质素，促进木栓形成层出现，进而在一定程度上促进‘果锈’形成，‘果锈’指数升高。

　　从生理生化角度分析，同一成熟时期，CK葡萄果皮酚类物质含量最多，木质素合成最多，含量最大，促进木栓形成层出现，从而在一定程度上促进果面锈斑形成（鞠志国，1991；陈建中，2008）；Ⅰ和Ⅱ处理的‘阳光玫瑰’葡萄酚类物质和木质素含量依次减少，在一定程度上抑制木栓形成层的发生，但果皮表面仍有不同程度的锈斑生成，CPPU浓度加大，‘果锈’显著减少；Ⅲ和Ⅳ处理的葡萄酚类物质和木质素含量很低，木栓层活动弱，果实果面几乎无锈斑。综上所述，同一成熟时期，CPPU处理显著降低葡萄果皮中白藜芦醇、没食子酸、香豆酸等酚类物质含量和木质素含量，木栓层活动受到抑制，一定程度上抑制‘果锈’生成，CPPU浓度为10 mg·L-1和15 mg·L-1时，果面几乎无锈斑。

　　本实验表明，GA3与不同浓度的CPPU组合处理‘阳光玫瑰’果穗，能显著减少果皮表面锈斑生成。总体来说，使用25 mg·L-1GA3＋5mg·L-1CPPU处理的‘阳光玫瑰’葡萄果面洁净，锈斑较少，成熟期适中，显著提高商品价值。因此， GA3与CPPU组合浸蘸果穗是生产上解决‘阳光玫瑰’葡萄 ‘果锈’问题的有效方法，推荐使用25mg·L-1GA3＋5mg·L-1CPPU的处理浓度。