病毒病防控岗位
范旭东
董雅凤 张尊平 任芳
葡萄扇叶病，又名葡萄扇叶退化病，为最早报道的葡萄病毒病，是影响葡萄正常生长，导致其产量下降和品质降低的重要因素之一。该病在全世界广泛分布，亚洲、非洲、欧洲、新西兰、南澳大利亚、南美、北美均有该病害发生的报道。受葡萄扇叶病危害较大的葡萄可严重影响坐果，导致果穗疏松、果粒大小不一，并产生较多的小果和无籽果，使果实的成熟也变的无规律；葡萄扇叶病还可导致葡萄糖含量和可滴定酸度的下降，从而影响果实品质；在感病的葡萄植株上，葡萄的生根能力和嫁接存活率都大幅降低。葡萄扇叶病可导致10%-80%的产量损失，同时，感染GFLV的葡萄园的生产年限也明显缩短，由30～40年或更长缩短到15～20年。
能够引起扇叶病的病原通常认为是葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleafvirus ,GFLV），属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)线虫传多面体病毒属(Nep
o v i r u s)。此外，几种线虫传多面体病毒能引起欧洲和地中海地区的葡萄产生衰退症状，这些症状与葡萄扇叶病症状相似，且不容易区分。这些病毒具有局部地域发生性，目前仅仅在一些局部地区报道。
值得注意的是，其他的葡萄病毒也能造成类似葡萄扇叶病的病害，包括灰比诺葡病毒（Gr a pevi nepinot gris virus, GPGV），葡萄浆果内坏死病毒（G ra p e
v i n e be rr y i n n ernecrosis virus, GINV）及葡萄蚕豆萎焉病毒组病毒（Grapevine
fabavirus，GFabV）。其中，GPGV于2012年在意大利首次报道，能够引起葡萄叶片产生褪绿斑驳、皱缩、变形等症状，目前，世界上20多个国家报道了该病毒。GINV于1997年首次在日本报道，2016年我们首次在中国发现，能引起葡萄叶片产生环斑症状。GFabV是最近鉴定出来的一种新的葡萄病毒，目前仅美国和我们课题组报道。研究初步表明GFabV能引起贝达葡萄产生褪绿斑驳、皱缩等症状。
对表现明显症状的葡萄，可凭肉眼直接观察，判断其是否感染葡萄扇叶病及类似病害。而对于一些症状不明显或者潜隐的葡萄样品，需通过病毒检测来确定是否存在相关病毒。病毒检测最常用的方法包括指示植物法、酶联免疫吸附法和RT-PCR方法。目前，一些病毒由于尚未制备出抗血清，无法采用酶联免疫吸附法进行检测。而且，酶联免疫吸附法与分子检测方法相比，灵敏度较差。因此，目前生产上最常见的方法为指示植物法和RT-PCR方法。在这里，将介绍葡萄扇叶病及类似病害的症状识别、指示植物和RT-PCR检测方法。
1 症状识别
该类病害主要表现两类症状，即传染性畸形和黄化花叶。传染性畸形由病毒‘变形’株系引起，叶片表现各种各样的畸形症状，包括严重的变形，不对称，皱缩，也可引起叶柄凹大宽张，叶裂加深，叶缘锯加深。芽和枝条也会发生畸形，主要表现为异常分支，双芽，短的节间，扁化簇生，Z字形生长。花束比正常的少且小，果实大小不均匀，小果，且果实品质差。黄化花叶症状主要由‘变色’病毒株系引起，在早春叶片表现明亮的铬黄斑。叶片最初表现为分散的黄斑，有时表现线形斑或者环斑，逐渐发展成为严重的花叶症状，最后可变成全黄。随着夏季温度的升高，黄斑减弱甚至恢复绿色。有时同时发生叶片变形和花叶症状。叶片症状在早春表现，整个生长季节均能表现，但在夏季表现的不太明显。另外，感染葡萄扇叶病的葡萄有时也表现脉带症状，成熟叶片沿主脉产生褪绿黄斑，渐向脉间扩展，其症状一般在夏季中晚期的少数葡萄样品上发生。常见的扇叶病及类似病害的症状见图1。
2 指示植物法
目前，绿枝嫁接法被认为是快速鉴定病毒的嫁接方法。在春季，选择半木质化的接穗，去掉叶片，立即进行嫁接或保湿放入4度冰箱保存待用。指示植物选择1-2年生的扦插脱毒苗，健壮新梢枝条留10-15cm长作为嫁接用。嫁接时，截取含萌芽的接穗茎段，嫁接至待测葡萄样品上，嫁接的茎段成活后，定期观察处于嫁接口下方的指示植物新生叶片的症状表现，一般至少需1-3个月，长则1-2年。GFLV可以沙地葡萄为指示植物。GPGV、GINV和GFabV可采用贝达葡萄作为指示植物。
3 RT-PCR检测方法
参照范旭东等人（2014，植物病理学报）报道的吸附柱提取法，快速提取葡萄叶片或韧皮部RNA，利用核酸浓度检测仪检测提取的RNA溶液的浓度与纯度。根据参考文献的方法，或采用反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，
进行GFLV、GPGV、GINV和GFabV等几种病毒的RT-PCR扩增，引物信息见表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。其中，GFLV的检测需要进行
式PCR扩增，以FL-MP1a/1b引物的扩增产物稀释10倍为模板，以FL-MPn1a/1b引物进行第二轮的PCR扩增。每次PCR均设置阴性和阳性对照。PCR结束后，取5 ul PCR产物混合6×loading buffer，于浓度为1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结束后将凝胶放入EB溶液染色10min，最后，采用凝胶成像系统进行观察，对结果进行判定。