华东华南栽培岗位

王继源　冯娇　侯旭东　陶建敏

 

　　摘 要：【目的】为探讨不同果袋对葡萄香气的影响,以‘阳光玫瑰’葡萄为材料,套4种不同果袋,普通单层白纸袋、透明微孔塑料袋、双层外黄内纸袋和单层绿纸袋，以普通单层白纸袋为对照（以下简称白袋、透明袋、袋和绿袋）。【方法】采用实时荧光定量PCR法分析脱氧木酮糖磷酸合酶基因(DXS3)、香叶基二磷酸合酶基因（GPPS）、里那醇合成酶基因（LIS）的表达变化,利用GC-MS技术测定葡萄香气组分。【结果】与对照相比，透明袋果实较大，可滴定酸含量偏低,但可溶性固形物含量最高,糖酸比高，差异显著；套纸袋和绿袋果实可溶性固形物较低。透明袋果实DXS3、GPPS和LIS基因表达量上调,促进单萜物质生成,单萜物质含量丰富,而套袋抑制了基因表达,推迟了基因表达高峰,影响单萜物质生成。套绿袋果实和对照相比基因表达量没有显著性差异。套透明袋果实中单萜类物质特征香气里那醇含量丰富,香叶醇、橙花醇、萜品醇等辅助类香气含量也很高,玫瑰香气浓郁；而套袋果实则特征香气含量最少；套绿袋果实香气物质种类少。【结论】不同的果袋对‘阳光玫瑰’葡萄果实香气组分及合成相关基因表达量的变化有显著的差异。

　　关键词：葡萄；套袋；基因表达；香气

 

　　果实套袋技术已广泛应用于葡萄的生产栽培。目前,在苹果、梨、葡萄等果树上已有许多报道，果实套袋，可以改善外观质量，减少农药残留，防止病虫害，耐贮藏，有效提高果实的商品性。

 

　　葡萄商品性评价包括外观、风味及市场适应性等。果实的风味物质由呈香和呈味物质组成，包括糖、酸、酚及芳香性物质等。香气是葡萄的重要感官指标之一。香气的种类和含量决定着葡萄的风味和品种典型性。在桃上，郭东花等对‘阿布白’桃果实香气的研究表明，套袋提高了桃果实中醇类物质的含量，降低了酯类物质的含量；套袋果实之间的特征性香气成分也存在差异，单层外黄内黑纸袋的内酯类物质较其他果袋含量高，可为果实提供丰富的果香味。赵峰等对‘红富士’苹果的研究表明，未套袋红富士苹果的芳香成分中酯类、醛类和醇类化合物的相对含量均较高,但以酯类化合物含量最高。套袋后红富士苹果果实风味变淡，芳香成分总量减少，而且由于酯类和醇类物质均有不同程度地降低，醛类为未套袋果的1.77倍, 红富士苹果的特有风味有所改变。杭洁等人对酿酒葡萄‘赤霞珠’和‘蛇龙珠’进行套袋遮光处理，研究表明，遮光处理可抑制样品酿酒葡萄果实醇类物质的释放，促进醛类物质释放。

　　‘赤霞珠’果实中萜烯类物质遮光处理样要略高于对照样，‘蛇龙珠’葡萄果实萜烯类含量却相反。套袋处理对不同品种的葡萄果实影响萜烯类合成途径有差异性。因而套袋不利于香气生成，会减少香气物质的种类和数量，导致风味淡化，而不同果袋对鲜食葡萄香气影响在国内鲜有报道。

　　玫瑰香型葡萄果实香气中含有丰富的单萜类物质，主要是里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇，对玫瑰香气贡献最大的是里那醇。DXS3、GPPS和LIS基因是单萜合成代谢途径中的前期、中期和晚期关键基因，其中LIS基因是里那醇合成酶，这些基因表达量的高低影响着单萜类物质合成量，从而影响玫瑰风味。

　　‘阳光玫瑰’葡萄，欧美杂交种，原产日本，其亲本为‘安芸津21号’和‘白南’，二倍体葡萄品种，明亮的黄绿色果皮，脆而多汁的肉，浓郁的玫瑰香味，鲜食风味佳。本试验以‘阳光玫瑰’为试验材料，套4种不同果袋，一是为了探明不同果袋对‘阳光玫瑰’果实香气组分和特征香气影响，为提高果实品质、改善风味提供依据；二是为了了解不同果袋对果实中单萜生物合成途径中关键酶基因的转录情况的影响，研究香气调控机制,三是为了葡萄生产栽培选择适宜的果袋。

　　1　材料与方法

　　1.1 材料

　　试验于2015年4-10月在南京农业大学汤山葡萄试验基地进行。平棚架“H”型整形，避雨栽培，行株距为6.0m×3.0m。以6年生‘阳光玫瑰’葡萄为实验材料，供试果袋为：普通单层白纸袋、透明微孔塑料袋、双层外黄内黑纸袋和单层绿纸袋，花后5w，每种果袋选取长势一致的3棵植株，在每株树四个方向进行套袋，挂牌做标记，田间土肥水管理及病虫害防治同常规。

　　1.2 方法

　　1.2.1 样品采集

　　从7月25日开始，每隔10d取一次样，取6次，取样时兼顾阴阳两面，上中下随机采取50-60粒左右，每一株作为一个重复，共3个生物学重复，采样后立即放入冰盒,带回实验室进行基因表达方面实验。

　　于9月5日果实成熟时，采样检测其生理和香气物质。

　　1.2.2 果实品质分析

　　用电子游标卡尺测量果实纵横径，用电子天平精度(0.01 g)测定果实单果重，用RA-250手持式糖度计测定可溶性固形物含量，用酸碱中和滴定法测可滴定酸含量。

　　1.2.3 果实芳香化合物测定

　　仪器与试剂：Trace GC-MS联用仪（Finnigam, USA）；50/30μmPDMS/DVB/CAR SPME萃取头（Supelco, USA）；固相微萃取手柄（Supelco,USA）；PC-420D数字型磁力加热搅拌装置（Corning,USA）；3-辛醇标准品。挥发性成分的提取：将每一份葡萄果实样品进行清洗、破碎、榨汁、离心，取澄清液8 mL置于15mL顶空瓶中，加入磁力搅拌子、3.0g NaCl和5μL 818 mg/L的3-辛醇（内标），加盖密封。在50 ℃下水浴30min，然后置于磁力搅拌器上，插入萃取头，于50 ℃吸附40min，磁力搅拌子转速为950 r/min。吸附后，萃取头转移至220 ℃的气相色谱进样口中以无分流方式热解析2 min进行分析。

　　程序条件：采用 J&W122-4732DB-17ms(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，升温程序为：40 ℃保持5min，然后以2 ℃/min升至70 ℃,保持2min，以3 ℃升至120 ℃，再以5 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至220 ℃，保持2min。转移线温度为280 ℃。质谱检测器采用EI模式，电压为70 eV；离子源温度为230 ℃；扫描速率为2.88 scan/s；质谱检测范围为m/z29-540，载气为氦气，流速为1.0 ml/min。

　　1.2.4 总RNA的提取和荧光定量PCR

 

 

 

　　采 用 RNA 提取试剂盒（Foregene）提取果实总RNA，以总RNA为模板利用Takara PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。荧光定量RT-PCR以EFl-a为内参基因，在萜类类生物合成途径中的3个关键酶基因的引物参照Martin，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。PCR20μL反应体系为：Takara SYBR PremixEx Taq（TaKaRa 10μL，上游引物和下游引物各0.4μL，稀释10×的cDNA 1μL和8.2μL去离子水。反应程序如下：95 ℃预变性4 min，95℃变性20s，60 ℃退火20s，72 ℃延伸40s，40个循环。

　　1.3 数据处理

　　质谱图采用标准谱库NIST/WILEY和相关文献搜索,用峰面积归一法测得相对含量,所测物质用3-辛醇定量,实验数据采用Excel、SPSS17.0软件进行统计分析。计算公式为：

各组分含量（ng/g）= ［各组分的峰面积/(内标的峰面积×样品量/g)］×内标浓度（g/l）×内标用量（μl）×1000

　　2　结果与分析

　　2.1 不同果袋对果实品质的影响

　　果实品质的好坏取决于大小、单果重和糖酸比等指标。由表2可以看出，与对照相比，套透明袋果实纵横径和单果重最大，其他套袋果实间没有显著性差异。套透明袋果实的可滴定酸含量偏低，但可溶性固形物含量最高，糖酸比高，差异显著；套黑纸袋和绿袋果实可溶性固形物较低，糖酸比低。

　　2.2 不同果袋对葡萄果实香气成分的影响

　　2.2.1 不同果袋果实香气成分种类和总物质含量比较

 

 

 

　　由表3可以看出,不同果袋处理显著影响了果实中香气成分种类，套白袋葡萄果实香气成分种类有37种，套透明袋葡萄果实香气成分种类最多，为41种，比对照多了4种；套绿袋抑制了葡萄香气的生成,成分种类最少，为25种，比对照少了12种；套黑袋葡萄果实香气成分种类有33种，比对照少了4种。套袋果实香气成分主要是醇、醛、酮、酯、烯烃、烷烃、酚类化合物和其他八大类，其中以醇、醛和烷烃类物质最多。

 

　　由表4可以看出，醇类和醛类物质是‘阳光玫瑰’葡萄主要芳香物质，决定了葡萄果实的整体香味；酮类、酯类等其他物质含量低，构成葡萄香味的特异性。套透明袋果实中醇类物质含量最高,与对照相比有显著性差异；醛类物质含量4种不同套袋处理没有显著差异；酮类、酯类等其他物质含量4种不同套袋处理都有显著性差异。

　　2.2.2 不同果袋果实中醇类物质组分分析

 

　　由表5可以看出，醇类物质是‘阳光玫瑰’果实中主要的芳香化合物，其中含量丰富的特征香气物质单萜醇有5种，具有玫瑰木香气的里那醇含量最高，且不同处理中，里那醇含量分别为27.86、223.13、79.33、101.94 ng˙g-1，是葡萄果实中重要的呈味香气，套透明袋的果实中里那醇含量最高，最低的为套黑袋的葡萄果实。同时，套透明袋的果实中还含有较高香气物质含量的有花香气的顺式氧化里那醇、α-萜品醇,有较多的玫瑰花香气的香叶醇、有青甜的橙花和玫瑰花香气的橙花醇,其含量分别为11.29、6.53、7.59、3.74 ng˙g-1。套袋果实特征香气物质含量最低，套绿袋特征香气物质种类最少。除单萜醇类化合物外，具有青草味的己醇也有较高的含量，套透明袋处理偏低。此外，在成熟葡萄果实中，乙醇含量相当高，套透明袋果实中最多，具有“酒化”的效应。

　　2.2.3 不同果袋果实中醛类物质组分分析

 

 

　　由表6可以看出，醛类物质作为‘阳光玫瑰’果实中主要芳香物质，其中的具有绿叶清香和果香的2-己烯醛的含量最高，分别为552.32、521.80、618.04、602.21ng˙g-1,4个不同套袋处理没有显著性差异。具有青香和果香的2,4-己二烯醛在套黑袋果实中含量最高,与其他3个处理间有显著性差异。套透明袋和套白袋果实中的具有花香的苯乙醛含量较高。套绿袋和套白袋果实中的具有甜香、柑橘香、花香的癸醛含量较高。2-己烯醛、2,4-己二烯醛、苯乙醛和癸醛是4个套袋处理所共有的香气成分。

2.2.4 不同果袋果实中醛类物质组分分析

 

　　由表7可以看出，‘阳光玫瑰’果实香气中酮类物质种类较少,具有青甜香、微玫瑰香气的香叶基丙酮在4个处理中都有检测到,且套白袋果实中含量最多。2-戊基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮为套透明袋果实所特有，2-十九烷酮为套白袋果实所特有。酯类物质含量较低，套绿袋果实中酯类物质种类和含量最少，只有一种。具有芳香味的邻苯二甲酸二异丁酯含量最高，4个处理中都含有,套绿袋果实含量较低，分别为3.13、2.38、0.39、1.08 ng˙g-。

　　2.2.5 不同果袋果实中烷烃类、烯烃类类物质组分分析

 

 

　　由表8可以看出，烷烃类物质种类也很多，烷烃类、烯烃类物质对葡萄香气也有重要的影响。4种处理中，都含有2种硅氧烷类化合物：十甲基环五硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷，而套白袋果实还特有一种硅氧烷类化合物：八甲基环四硅氧烷。套黑袋和透明袋的果实中含有烯烃类化合物种类最多，长叶环烯和长叶烯具有木香；套绿袋果实中只有一种烯烃类物质：1-十六烯；套白袋果实中没有烯烃类物质。

　　2.2.6 不同果袋果实中烷烃类、烯烃类类物质组分分析

 

 

　　由表9可以看出，‘阳光玫瑰’果实香气中酚类物质种类较少，具有刺激味的2,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚在4个处理中都有检测到，套透明袋和绿袋果实中香气含量较多；套黑袋和绿袋果实香气中还检测出了有刺激味的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，含量较低，为0.24、0.13 ng˙g-1。其他的化合物种类少，含量低。

2.3 不同果袋对葡萄果实香气相关基因表达的影响

 

 

　　如下图1，在果实发育过程中，与白袋相比，套透明袋果实的单萜合成前期关键基因DXS3的表达含量在转色期后开始缓慢上升,到花后100 d左右的时候达到最高峰值,差异显著，之后开始下降。套绿袋果实的基因表达量最高峰值推迟到花后110 d左右，与白袋相比没有显著性差异。套黑袋果实基因表达量上调缓慢，且显著低于对照。

 

　　在合成途径的中期，与白袋相比，套透明袋果实的GPPS基因表达量在转色期后缓慢上升，花后100 d左右达到峰值，差异显著。套绿袋果实的基因表达量最高峰值出现时期被推迟，最高峰值与白袋相比没有显著性差异，而套黑袋果实的表达量持续上调中。

　　在合成途径的后期，与白袋相比，套透明袋果实的LIS基因表达量在花后80d后开始急剧上升，在花后100 d达到最大量，峰值最高，差异显著。绿袋基因表达量花后90d之前都在缓慢上升，最高出现在花后110 d。黑袋基因表达缓慢且峰值显著低于白袋。

　　以上结果说明, 相较于对照，透明袋处理促进了香气合成相关基因的表达，DXS3、GPPS和LIS基因表达量上调，有利于香气的合成，丰富单萜物质。黑纸袋处理延缓了葡萄的生长发育，抑制了香气相关基因的表达，表达量下降。套绿袋果实基因表达量变化与对照没有显著性差异。

　　果实套袋后，其生长发育的微域环境发生改变，影响了果实品质。王少敏等研究结果表明，套袋降低了果实中可溶性固形物、糖类等物质的含量。本实验中，与对照相比，套透明袋果实中可溶性固形物含量最高，套黑袋和绿袋果实中含量较低，这与不同果袋的透光率有关。透光率高的果袋可以促进葡萄果实的生长，增强其光合作用，提高果实含糖量，果实增重增大。透光率低的果袋减弱了光合同化物的来源，源强降低，不利于向果实运输养分，减少了果实碳同化物积累。本研究中，不同果袋果实可滴定酸含量无显著变化（P<0.05），可溶性固形物的高低影响着糖酸比，不同的糖酸比使果实整体口感有所不同，改变了果实甜度风味。

　　果实香气挥发性化合物主要是由醇类、酯类、醛类、酮类、内酯和萜类化合物等构成。不同水果有着独特的芳香味道取决于该水果的特征香气浓度与香气阀值。玫瑰香型葡萄果实香气中含有丰富的单萜类物质，主要是里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇，对玫瑰香气贡献最大的是里那醇。本研究中，与对照相比，套透明袋果实中里那醇含量丰富，香叶醇、橙花醇、萜品醇等辅助类香气含量也很高，玫瑰香气浓郁；而套黑袋果实则特征香气含量最少；套绿袋果实香气物质种类少。李芳芳等研究报道，套袋不利于梨果实香气物质的形成，比起套单层白袋，套紫色塑料膜袋综合性能更好。李慧峰等报道，不同材质果袋对苹果香气影响有差异，套塑膜袋果实香气总含量略低于不套袋果实，套双层纸袋果实香气总含量为不套袋果实香气总量的 59.97%，套反光膜袋果实香气总含量为不套袋果实香气总量的79.67%。这种差异可能与不同材质果袋的透光率、温度湿度等微域环境有关。Zhang等认为，弱光会抑制玫瑰香型葡萄单萜的积累，醇、醛等物质生成减少，风味变淡。至于不同果袋对葡萄香气的影响机制，有待深入研究。

　　玫瑰香型葡萄果实中含有丰富的萜类物质，挥发性的萜类化合物物主要由异戊二烯(C5)、单萜(C10)和倍半萜烯(C15)构成，其中最为丰富的是单萜类化合物，其主要合成途径是甲基磷酸赤薛糖途径(methyl-erythritol-4-phosphatepathway, MEP)，最主要的单萜类物质是里那醇,对玫瑰香气的贡献值最大。DXS3、GPPS和LIS基因是单萜合成代谢途径中的前期、中期和晚期关键基因。DXS3与单萜物质积累规律相一致,转色期后持续上升至成熟期，之后下降。

　　GPPS基因表达量上调，促进相应单萜底物GPP的合成，有利于单萜物质的生成。结合本实验结果，与对照相比，套透明袋果实DXS3、GPPS表达量最高，促进单萜物质生成，LIS基因的大量表达使得玫瑰香型葡萄特征香气里那醇含量提高，而套黑袋抑制了基因表达，推迟了基因表达高峰，影响单萜物质生成。套绿袋和对照果实基因表达量没有显著性差异。这与所测单萜类物质含量相一致。

　　综上所述，与对照相比，套透明袋果实较大，糖酸比高，香气合成相关基因表达量高，单萜类物质含量高，玫瑰香味浓郁；套黑纸袋果实香气合成成受抑制，基因表达量下调；套绿袋果实香气种类最少，基因表达量无显著性差异。