华东华南栽培岗位

王继源 陶建敏

 

　　摘 要：【目的】研究不同浓度CPPU对葡萄果实香气组分及合成相关基因表达的影响，为阐明香气物质的合成提供理论依据。【方法】以‘阳光玫瑰’葡萄为材料，花期用25 mg•L-1 GA3处理花序，花后两周用25mg•L-1 GA3 + 0mg•L-1 CPPU处理果穗作为对照(Control)，设置25mg•L-1 GA3 + 5mg•L-1 CPPU、25mg•L-1 GA3 + 10mg•L-1 CPPU、25mg•L-1 GA3 + 15mg•L-1CPPU 3个处理(以下简称I、II、III处理)，采用实时荧光定量PCR法研究香气合成相关基因脱氧木酮糖磷酸合酶基因(DXS3)、香叶基二磷酸合酶基因（GPPS）、里那醇合成酶基因（LIS）的表达变化，利用GC-MS技术测定葡萄香气组分。【结果】与对照相比，I和II处理的果实显著增大、增重，可滴定酸含量和可溶性固形物有所下降，外观品质提高，III处理因CPPU浓度过高而引起品质下降；与对照相比，香气种类减少，萜类物质特征香气里那醇、顺式氧化里那醇、香叶醇等相对含量降低，风味变淡，且CPPU浓度过高，则不利于香气的产生；与对照相比，经不同浓度CPPU处理的果实中香气合成相关基因DXS3、GPPS、LIS表达量高峰推迟且峰值下调，浓度越高，推迟时间越久，峰值更低，基因表达受抑制，这与萜类物质相对含量降低相一致。【结论】研究认为，就改善‘阳光玫瑰’葡萄外观品质的同时保证内在品质而言，25 mg•L-1 GA3 + 5 mg•L-1 CPPU处理效果最佳。

 

　　关键词：GA3；CPPU；果实品质；基因表达；香气

 

　　‘阳光玫瑰’葡萄为欧美杂交种，原产日本，其亲本为‘安芸津21号’和‘白南’，二倍体葡萄品种，葡萄浆果果皮为明亮的黄绿色，肉质脆而多汁，具有浓郁的玫瑰香味，果汁可溶性固形物 20%左右，鲜食风味佳，成熟期较晚，挂果期长，成熟后可挂果2-3个月。因其果实品质好，易于栽培，近年来种植面积逐渐增加。

 

　　GA3和CPPU作为植物生长调节剂广泛用于葡萄的生产栽培，GA3能够促进种子萌发、细胞伸长、预防落花落果、提高光合作用等；CPPU能够促进细胞分裂、诱导愈伤组织生长、细胞扩大、延缓衰老等作用，因而能够增加产量，提高葡萄的商品性。葡萄商品性评价包括外观、风味及市场适应性等。GA3和CPPU的使用，对于葡萄外观品质的改善是显而易见的，同时对于葡萄风味也有一定的影响，这方面在国内鲜有报道。果实的风味物质由呈香和呈味物质组成，包括糖、酸、酚及芳香性物质等。香气是葡萄的重要感官指标之一。香气的种类和含量决定着葡萄的风味和品种典型性。葡萄香气种类多，主要有萜烯类、C13-降异戊二稀及其衍生物、甲氧基吡嗪、硫醇化合物等，以游离态和糖苷结合态形式存在。葡萄玫瑰香味中香气成分最多的是单萜类物质，主要呈香物质是里那醇和香叶醇。本实验用GA3和CPPU处理葡萄果穗，研究‘阳光玫瑰’果实中单萜生物合成途径中关键酶基因的转录情况和香气组分的变化，以期为揭示香气物质合成的调控机制提供理论依据。

 

　　1　材料与方法

 

　　1.1　材料

 

　　试验于2015年4-10月在南京农业大学汤山葡萄试验基地进行。平棚架“H”型整形，避雨栽培，行株距为6.0m×3.0m，南北方向。以6年生‘阳光玫瑰’葡萄（嫁接）为实验材料，选取长势一致的植株，每处理3棵，挂牌做标记，田间土肥水及病虫害防治同常规管理。处理前修剪花序，序尖留约4cm，于5月16日盛花期花序用25mg•L-1 GA3浸泡5s，2w后用25mg•L-1 GA3与 0、5、10、15mg•L-1 CPPU分别组合再次浸泡5s，每处理3棵树，单株为1次重复，其中对照(Control)为25mg•L-1GA3 + 0 mg•L-1 CPPU处理。

 

　　1.2　方法

 

　　1.2.1　样品采集

 

　　从7月25日转色期开始，每隔10 d取一次样，取6次，从3个生物学重复的植株上随机采集，取样时兼顾阴阳两面，上中下随机从20串左右果穗上采集50-60粒，每株为一个重复，共3个重复，采样后立即放入冰盒，带回实验室进行实验。果实达到生理成熟时，检测其香气物质。

 

　　1.2.2　果实品质分析

 

　　采集的浆果首先全部可用电子游标卡尺测量果实纵横径，用电子天平精度（0.01 g）测定果实单果重，然后从中选取10粒浆果用RA-250手持式糖度计测定可溶性固形物含量，再选10粒浆果用酸碱中和滴定法测可滴定酸含量，选20粒浆果用于RT-PCR分析，最后20粒左右用GC-MS法检测香气物质。

 

　　1.2.3　果实芳香化合物测定

 

　　仪器与试剂：Trace GC-MS联用仪（ Finnigam，USA）；50/30μmPDMS/DVB/CAR SPME萃取头（Supelco，USA）；固相微萃取手柄（Supelco，USA）；PC-420D数字型磁力加热搅拌装置（Corning，USA）；3-辛醇标准品。

 

　　挥发性成分的提取：将每一份葡萄果实样品进行清洗、破碎、榨汁、离心，取澄清液8ml置于15ml顶空瓶中，加入磁力搅拌子、3.0gNaCl和5μL 818mg/L的3-辛醇（内标），加盖密封。在50℃下水浴30min，然后置于磁力搅拌器上，插入萃取头，于50℃吸附40min，磁力搅拌子转速为950r/min。吸附后，萃取头转移至220℃的气相色谱进样口中以无分流方式热解析2min进行分析。

 

　　程序条件： 采用J & W 1 2 2 - 4 7 3 2 D B -17ms(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，升温程序为：40℃保持5min，然后以2℃/min升至70℃，保持2 min，以3 ℃升至120℃，再以5℃/min升至150℃，最后以10℃/min升至220℃，保持2min。转移线温度为280℃。质谱检测器采用EI模式，电压为70eV；离子源温度为230℃；扫描速率为2.88scan/s；质谱检测范围为 m/z 29-540，载气为氦气，流速为1.0ml/min。

 

　　1.2.4　总RNA的提取和荧光定量PCR

 

　　采用R N A 提取试剂盒（Foregene）提取果实总RNA，以总RNA为模板利用Takara PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。用仪器ABI 7300进行荧光定量RT-PCR，以EFl-a、Ubiquitin为内参基因，萜类生物合成途径中的3个关键酶基因的引物参照Martin，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。

 

 

 

　　RT-PCR20μL反应体系为：TakaraSYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL，上游引物和下游引物各0.4μL，稀释10×的cDNA1μL和8.2μL去离子水。反应程序如下：95℃预变性4min，95℃变性20 s，60℃退火20s，72℃延伸40s，40个循环。计算公式为 X = 2-ΔΔCt，ΔCt = Ct（目的基因）- Ct（内参基因）。

 

　　1.3　数据处理

 

　　质谱图采用标准谱库NIST/WILEY和相关文献搜索，用峰面积归一法定量，所测物质为3-辛醇的相对含量。实验数据采用Excel、SPSS17.0软件进行统计分析。

 

　　2　结果与分析

 

　　2.1　GA3配合不同浓度CPPU处理对果实品质的影响

 

　　果实品质的优劣部分取决于大小、单果重和糖酸比等指标。由表2可以看出，GA3配合CPPU的处理使果实显著增大、增重，其中I和II处理果实的增幅最大，III处理的次之。对照果实的酸度和可溶性固形物都是最高，I和II处理果实的可溶性固形物低于对照果实，但酸度很低，而III处理果实的可溶性固形物低，酸度又高。以上结果表明，GA3配合不同浓度的CPPU处理对果实品质有显著影响，在适宜的浓度内，提高了果实的品质，I和II处理果实的品质最好，而CPPU浓度过高，则使果实品质有所下降。

 

　　2.2　GA3配合不同浓度CPPU处理对葡萄果实香气成分的影响

 

　　2.2.1　GA3配合不同浓度CPPU处理果实香气成分种类比较

 

 

　　由表3可以看出，不同浓度处理果实香气成分主要是醇、醛、酮、酯、烯烃、烷烃、酚类化合物和其他八大类，经过I、II、III处理的葡萄果实香气成分种类减少，3个处理间种类总数没有显著性差异。II处理果实中香气成分种类与对照相比，醇类、烷烃类和其他类分别减少了1、3、2种，酮类和酚类化合物都增加了1种，其余种类与之相同，香气成分种类上比对照少了4种；II处理的果实中香气成分种类与对照相比，醇类、酯类和其他类分别减少了3、1、3种，醛类、烯烃类和酚类化合物分别增加了2、1、1种，其余种类与之相同，香气成分种类上比CK少了3种；III处理的果实中香气成分种类与对照相比，醇类、醛类、酯类、烷烃类和其他类分别减少了4、1、2、1、2种，烯烃类增加了4种，其余种类与之相同，香气成分种类上比对照少了4种。

 

　　由表4可以看出，醇类是‘阳光玫瑰’葡萄果实中主要的香气成分，其次为醛类。I处理的果实中香气成分种类相对含量与对照相比，醇类、酯类、烷烃类和其他类分别减少了4.77%、0.08%、0.32%、0.22%，醛类、酮类和酚类化合物分别增加了4.97%、0.24%、0.13%，均未检测到烯烃类物质；II处理的果实中香气成分种类相对含量与对照相比，醇类、酮类、酯类、烯烃类、酚类化合物和其他类分别减少了6.9%、0.05%、0.04%、0.35%、0.46 %、0.23%，醛类和烯烃类分别增加了7.7%、0.02%；III处理的果实中香气成分种类相对含量与CK相比，醇类、酮类、酯类、酚类化合物和其他类分别减少了11.56%、0.06%、0.39%、0.59%、0.22%，醛类、烯烃类和烷烃类分别增加了12.64%、0.13%、0.04%。

 

　　2.2.2　GA3配合不同浓度CPPU处理果实中醇类物质组分分析

 

　　由表5可以看出，醇类物质是‘阳光玫瑰’果实中主要的芳香化合物，其中含量丰富的单萜醇都有5种，具有玫瑰木香气的里那醇含量最高，且不同处理中，里那醇相对含量分别为14.78%、10.05%、9.30%、7.85%，是葡萄果实中重要的呈味香气，对照果实中里那醇含量最高，最低的为III处理的葡萄果实。同时，对照的果实中含有较高相对含量的有花香的顺式氧化里那醇、α-萜品醇和玫瑰花香气的香叶醇，其相对含量分别为0.38%、0.42%、0.12%。有青甜的橙花和玫瑰花香气的橙花醇的相对含量，在四个处理中无显著差异。除萜烯醇类化合物外，具有青草味的己醇也有较高的相对含量，其中以III处理果实中含量最高。此外，在成熟葡萄果实中，乙醇相对含量相当高，且随CPPU浓度升高有降低的趋势，具有“酒化”的效应。

 

　　2.2.3　GA3配合不同浓度CPPU处理果实中醛类物质组分分析

 

 

　　由表6可以看出，醛类物质作为‘阳光玫瑰’果实中第二大类芳香物质，其中具有绿叶清香和果香的2-己烯醛的相对含量最高，分别为31.71%、37.57%、40.66%、45.58%，III处理的最高，对照最低。具有青香和果香的2,4-己二烯醛在对照果实中含量最高，CPPU处理的果实相对含量降低，且处理间没有显著差异。对照和I处理果实中的具有花香的苯乙醛和具有甜香、柑橘香、花香的癸醛相对含量无显著差别，但均高于II处理和III处理。壬醛和十八醛为对照所独有香气成分，十二醛为I处理果实独有香气成分，十五醛、金合欢基乙醛和十四烷醛为II处理果实独有香气成分。

 

　　2.2.4　GA3配合不同浓度CPPU处理果实中醛类物质组分分析

 

 

　　由表7 可以看出，‘ 阳光玫瑰’果实香气中酮类物质种类较少，具有青甜香、微玫瑰香气的香叶基丙酮在4个处理中都有检测到，且对照和I处理果实中相对含量较多。3-辛酮具有果实香味，只在I处理的果实中检测到，其相对含量为0.26%。酯类物质含量较低，III处理果实含有的酯类物质种类和含量最少，只有一种。具有芳香味的邻苯二甲酸二异丁酯相对含量最高，4个处理中都含有，III处理果实相对含量较低，分别为0.40%、0.32%、0.35%、0.03%。

 

　　2.2.5　GA3配合不同浓度CPPU处理果实中烷烃类、烯烃类类物质组分分析

 

　　由表8可以看出，烷烃类、烯烃类物质对葡萄香气也有重要的影响。4种处理中，都含有3种硅氧烷类化合物：十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷和十六甲基环八硅氧烷，而III处理果实还含有另外两种硅氧烷类化合物：十八甲基环九硅氧烷和二十甲基环十硅氧烷。烯烃类化合物以III处理的果实香气中最多，达4种，有柠檬香味的柠檬烯、松木香的3-蒈烯、木香的长叶环烯和长叶烯；II处理的果实香气中只有柠檬香味的柠檬烯，为0.02%，相对含量低；其他两个处理不含有烯烃类化合物质。

 

　　2.2.6　GA3配合不同浓度CPPU处理果实中烷烃类、烯烃类类物质组分分析

 

 

　　由表9 可以看出，‘ 阳光玫瑰’果实香气中酚类物质种类较少，具有刺激味的2,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚在4个处理中都有检测到，对照和I处理的果实香气中相对含量较多；I和II处理的果实香气中还检测出了有刺激味的对叔丁基苯酚，相对含量较低，为0.01%、0.01%。其他的化合物以对照最多，有3种，为丙二酰肼、二苯胺、三苯基氧化膦，相对含量分别为0.03%、0.01%、0.19%；II处理的果实中没有。

 

　　2.3　GA3配合不同浓度CPPU处理对葡萄果实香气相关基因表达的影响

 

 

　　图1 表明，在果实发育过程中，对照果实的单萜合成前期关键基因D X S3的表达量在转色期后开始缓慢上升，到花后100d左右时达到最高值，之后开始下降，I和II处理果实基因表达量最高峰值推迟到花后110d左右，且低于对照，无显著差异，III处理果实基因表达量低，且持续上调中。

 

　　在单萜类物质合成中期，对照果实中GPPS基因的表达量在转色期后缓慢上升，花后100d左右达到峰值，之后开始下降，I和II处理果实基因表达量最高峰值出现时期被推迟，最高峰值与对照之间无显著差异，之后开始降低，而III处理果实基因表达量持续上调中。

 

　　在单萜类物质合成后期，对照果实LIS基因的表达量在80d后开始急剧上升，在花后100d达到最大。I和II处理果实的基因表达量在花后90d之前都在缓慢上升，最高出现在花后110d，且表达量峰值比对照低，III处理果实的LIS基因的表达量增长缓慢，花后100d后开始急剧上升。

 

　　以上结果说明， 高浓度的CPPU的处理延缓了香气相关基因的表达，抑制了其表达峰值，DXS3 和LIS基因表达量下调。随着果实成熟，基因表达量缓步上升，之后果实因过熟而表达量降低。香气相关基因的表达趋势与果实的成熟进程相一致。

 

　　3　讨论

 

　　GA3和CPPU作为植物生长调节剂被广泛用于葡萄的生产上，GA3主要生理效应是促进幼嫩组织的细胞分裂和细胞生长，而CPPU具有诱导愈伤组织生长，促进芽的发育、种子的萌发，保绿和延缓衰老等显著的生理活性。GA3配合不同浓度CPPU的处理，相较于只用GA3，葡萄果实的纵横径、单果重显著增加，可溶性固形物却有所降低，改善了其外观品质，提高了葡萄的商品性，这与前人结果相一致。有研究表明CPPU浓度过高，会降低果实的品质。本实验表明，25 mg•L-1 GA3 + 15 mg•L-1 CPPU处理由于CPPU浓度过高，品质反而降低，25 mg•L-1 GA3 + 5 mg•L-1CPPU和25 mg•L-1 GA3 + 10 mg•L-1CPPU处理浓度都是适宜的。

 

　　不同处理果实香气成分主要是醇、醛、酮、酯、烯烃、烷烃、酚类化合物和其他八大类，玫瑰香型葡萄果实香气中含有丰富的单萜类物质，主要是里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇，对玫瑰香气贡献最大的是里那醇。I、II、III处理的葡萄果实与对照相比，香气成分种类减少，单萜类物质相对含量也减少，且CPPU浓度越高，相对含量有下降的趋势。萜类物质对葡萄风味有重要的影响，4个处理葡萄中里那醇相对含量分别为14.78%、10.05%、9.30%、7.85%，各个辅助性单萜类物质也有所降低，果实的玫瑰香味会淡化。C6化合物也是葡萄香气中的重要组分，如2-己烯醛、己醇等，具有青草味，I、II、III处理的葡萄果实香气成分中C6化合物呈增加趋势，过多的C6化合物不利于葡萄的特征香气的形成。此外，I、II、III处理葡萄中乙醇含量降低，有利于葡萄的采后贮藏。

 

　　玫瑰香型葡萄果实中含有丰富的萜类物质，挥发性的萜类化合物物主要由异戊二烯(C5)、单萜(C10)和倍半萜烯(C15)构成，其中最为丰富的是单萜类化合物，其主要合成途径是甲基磷酸赤薛糖途径(methyl-erythritol-4-phosphatepathway, MEP)，最主要的单萜类物质是里那醇，对玫瑰香气的贡献值最大。DXS3、GPPS和L IS基因是此单萜合成代谢途径前期、中期和晚期关键基因。DXS3与单萜物质积累规律相一致，转色期后持续上升至成熟期，之后下降。本实验中，I、II、III处理的葡萄果实与对照相比，DX S3、G P P S和LI S 基因转录峰值高峰期明显推迟，且表达量下调。浓度越高，高峰期后推且降低。本实验表明，过高浓度的CPPU处理不利于葡萄的香气合成相关基因的表达和香气物质的形成。

 

　　‘阳光玫瑰’葡萄玫瑰香味的变淡主要是由于萜类物质里那醇、香叶醇、橙花醇、萜品醇和香茅醇等物质的减少，其间接原因可能是CPPU抑制了ABA合成相关基因表达，延缓了生长期，推迟了ABA生成高峰且峰值变小。ABA是促进葡萄果实成熟衰老的首要激素，ABA的大量产生能促使乙烯释放高峰，乙烯能加快游离脂肪酸和异亮氨酸的增加，促进香气前体物质的形成；ABA生成受到抑制和减少，使乙烯同时受到了抑制，减少了香气物质的生成。直接原因是萜类物质合成主要基因DXS3、GPPS和LIS表达受到抑制，导致萜类物质合成减少，玫瑰香味淡化。

 

　　本试验结果表明，4个不同处理中，I、II、III处理的葡萄果实与对照相比，果实增大增重，香气种类和单萜物质含量减少，玫瑰风味偏淡，基因表达量高峰推迟且峰值下调，综合考虑，25 mg•L-1 GA3 +5 mg•L-1 CPPU处理效果最佳，提高了其商品价值。