病毒病防控岗位

周俊 范旭东 董雅凤 张尊平

　　葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleafvirus, GFLV）是葡萄扇叶病病原，可导致葡萄产量降低、品质下降，抗逆性减弱。目前，常用ELISA和RT-PCR两种方法对GFLV进行快速检测，我们在研究过程中，发现上述2种方法的检测结果存在一定差异，尤其是RT-PCR方法的检出率过低。为了改善和提高GFLV分子检测的灵敏度和可靠性，本团队研究建立了巢式RT-PCR检测方法，经验证，该方法检测灵敏度高，稳定可靠，可应用于田间葡萄样品和脱毒葡萄样品中GFLV的快速检测。

　　1　巢式PCR检测用引物

　　根据GenBank已公布的GFLV常见株系移动蛋白（MP ） 和外壳蛋白（CP ） 基因序列的保守区，设计8条用于GFLV巢式PCR扩增的简并引物（FL-MP1A、FLMP1B、FL-MPn1A、FL-MPn1B、FL-CP1A、FL-CP1B、FL-CPn1A、FL-CPn1B）。其中，FL-MP1A/B、FL-MPn1A/B引物扩增GFLV2AMP基因，扩增大小分别为676、546bp；FL-CP1A/B、FL-CPn1A/B扩增GFLV 2ACP基因，扩增大小分别为669、446bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　2　总RNA提取

　　采用柱式方法提取RNA，具体步骤如下：取约50mg葡萄组织与1mL 裂解液研磨释放RNA匀浆；匀浆离心后，取上清液600μL与300μL的无水乙醇混合，加入吸附柱中（购自北京艾德莱生物科技有限公司）；经多次漂洗后，用50μL无RNA酶的水洗脱总RNA；取5μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，合格的总RNA溶液立即用于反转录或者保存于-70℃超低温冰箱中备用。

　　3　反转录PCR

　　逆转录在1.5mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水9.0μL、6bp随机引物（上海生工生物工程技术服务公司合成）1.0μL、总RNA 5.0μL后，离心混匀95℃水浴5min，冰上放置5min。再依次加入5×M-MLV Buffer 5.0μL、2.5mmol/L dNTPs 3μL、200 U/μL M-MLV 0.5μL、灭菌纯水1.5μL，37℃ 水浴10min，42℃水浴50min，72℃水浴5min，合成的cDNA立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。巢式PCR第一轮反应体系为25μL：10×Taq buffer 2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L） 2.0μL，10mol/L引物1 0.5 μL，10 mol/L引物2 0.5 μL，DEPC水17.25μL，5U/μL Taq 0.25μL，cDNA 2μL；巢式第二轮PCR将Taq将量降为0.15μL，cDNA量降为1μL，减少的量用DEPC水补足。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后一轮循环后72℃延伸10min。

　　4　扩增产物克隆与测序

　　PCR反应结束后，取产物5μL于1 . 5%的琼脂糖凝胶1 2 0V进行电泳，EB染色后在凝胶成像仪下观察。PCR扩增获得的目的DNA片段采用北京艾德PCR FragmentRecovery Kit回收纯化，取4μL回收产物与pMD18-T试剂盒中的pMD18-T 1μL和Solution 4μL混匀后，于16℃连接1h即可用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行菌液培养，通过PCR鉴定获得的阳性重组质粒，随机选择其中3-6个阳性克隆子由北京诺赛基因组研究中心进行测序，以证实扩增产物为GFLV特异片段。

　　5　检测结果

　　利用这两套引物分别对59个样品进行检测，结果FLMP1、FLCP1仅17和53号样品有目的条带，而FLMPn1、FLCPn1分别检出30和21个样品有目的条带；FLMPn1、FLCPn1 检出样品中共有19个样品一致，均为阳性，该检测结果说明本实验建立的巢式RT-PCR检测方法是可靠的，且引物FLMPn1的检测结果更好，不仅检出样品较多，而且扩增目的条带也较引物FLCPn1清晰（图1）。