无核品种选育岗位

王跃进 张剑侠 张朝红 徐炎

　　1　取材

　　以种子败育型无核葡萄品种无核白、火焰无核、底来特、红宝石无核、黎明无核、赫什无核、波尔莱特、红无籽露等做母本，无核或有核葡萄做父本进行杂交，取其杂种胚为材料。

　　2　胚珠培养

　　在适宜时期取材，田间采摘的幼果带回实验室后，剪成小穗放入广口瓶内，先用自来水冲洗，用70% 乙醇浸润30秒后用无菌水冲洗1次，将广口瓶放入超净工作台，倒入含有效氯1％的次氯酸钠溶液浸泡果粒10-15分钟，期间振荡2-3次，再用无菌水漂洗2-3次。在超净工作台上用无菌的镊子和手术刀在培养皿中将无菌果粒剖开，从剖开果粒中选取长度大于2mm的胚珠培养在胚珠发育培养基中，设计使用ER、MS、B5、MM3分别添加6-BA 0，0.5，1.0，1.5，2.0mg/l+GA3 0，0.5，0.8，1.0mg/l + IAA0，1.0，1.5mg/l作胚发育培养基，进行正交设计；用薄层液体、固体和固液双层三种培养方式，每个150ml三角瓶内接种20个胚珠，进行暗培养，此阶段为胚珠培养阶段。8周后剥出胚，统计胚发育率。

　　3　胚萌发

　　60天后在解剖镜下剖开胚珠，在胚珠内的喙端发现的白色胚即为发育胚。有发育胚的胚珠数量占接种胚珠总数的比率即为胚发育率。将发育胚接种在WP＋BA 0.2mg/l＋蔗糖20 g/l的固体胚萌发培养基上，每只试管（20mm×150mm）接1个胚，胚刚接种7～10天内进行暗培养，胚开始萌动后改为光照培养。胚的子叶、胚根有伸长的视为萌发胚。以萌发胚数占接种胚数的比率作为胚萌发率。

　　4　生根成苗

　　待胚萌发长成正常完整苗后，剪成1 cm的带叶茎断接至1/2 MS +IBA 0.1 mg/l的继代生根培养基上生根（150 ml三角瓶），每瓶1株，光照培养。

　　5　壮苗继代扩繁

　　要提高胚挽救苗移栽成活率，移栽苗子的质量首先是关键，生长健壮的苗子移栽成活率就高，在获得胚挽救苗子后，首要的是培养生根强壮试管苗，因为试管苗要从无菌环境转到移栽基质中，特别是对于弱苗而言。在适应了外界环境的温湿度后，新根的发出包括根的长度，数量等的增加，从而保证试管苗根部具有从基质中吸收营养的能力，是试管苗从半异养转变成自养的前提，对驯化移栽的胚挽救苗生长起到重要作用。适宜胚挽救试管苗根及其植株壮苗生长的培养基是1/2MS+0.3 mg/l IAA

　　6　炼苗

　　生根后我们把材料转接到1/2MS+0.3 mg/l IAA+30 g/l蔗糖的培养基上，然后增加光强接近自然光强，这个过程一般被称为培养间炼苗，时间为7-14 d。在这个过程我们一般采用的是“闭口炼苗”，即培养瓶的封口膜不打开。如果打开组培瓶的封口膜，容易造成培养基滋生杂菌，这样将会一定程度的伤害胚挽救苗，特别是带着杂菌的试管苗移栽到地里，也会降低苗子的质量，我们认为从实验室到炼苗室再到温室，最后到大田，尽量防止每一步杂菌的滋生，也可以保证胚挽救杂交合子胚获得的新种质具有无病毒性，也就是无病毒苗，这也是做无核葡萄合子胚挽救工作者考虑的一个研究方面，在这个生根壮苗及培养间炼苗阶段如果出现有培养基污染的情况，这时候要及时将苗子移栽出来，处理得当这种苗子可以及时得到抢救，而驯化移栽成功，而不能将其直接丢弃，造成损失。前面两个阶段的苗子达到第三个阶段驯化的要求之后，就可以开展后面的工作，如果在这个阶段，有的苗子根和植株的生长势没有达到要求，继续重复这两个阶段的工作，使材料尽量达到要求后再开始基质的移栽。